Decreto-Lei n.º 249/2007, de 27 de junho

Decreto-Lei n.º 249/2007

de 27 de Junho

A doença provocada pelo agente patogénico Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., vulgarmente designada por doença do pus ou mal murcho da batateira e do mal murcho tomateiro, é um factor de redução da produção da cultura da batateira e do tomateiro, representando um risco para estas culturas não só no País como também em todo o território comunitário se não forem tomadas medidas de protecção eficazes.

Tornou-se, pois, necessário estabelecer medidas de controlo fitossanitário destinadas a evitar a introdução e a dispersão daquele agente patogénico no território nacional, competindo, para o efeito, à Direcção-Geral da Agricultura e Desenvolvimento Rural a definição, a elaboração, a coordenação e a aplicação do programa nacional de prospecção do organismo prejudicial.

Neste contexto, foi publicado o Decreto-Lei n.º 494/99, de 18 de Novembro, transpondo a Directiva n.º 98/57/CE, do Conselho, de 20 de Julho, relativa ao controlo de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., que definiu os procedimentos a adoptar para a implementação do referido programa, através nomeadamente de disposições técnicas quanto à forma de conservação das amostras testadas e rastreabilidade do organismo prejudicial.

Foi, entretanto, publicada a Directiva n.º 2006/63/CE, da Comissão, de 14 de Julho, que veio alterar os anexos II a VII da Directiva n.º 98/57/CE, do Conselho, de 20 de Julho. Estes anexos constituem praticamente todo o corpo da directiva e foram alterados, quer para fazer face aos avanços significativos em termos da compreensão da biologia, dos procedimentos de detecção e de identificação do agente patogénico quer para enquadrar a experiência obtida na luta contra aquele organismo prejudicial através da revisão de várias disposições técnicas relacionadas com as medidas de controlo.

No tocante aos procedimentos de detecção e de identificação, foram introduzidos procedimentos recentemente desenvolvidos como a hibridação fluorescente in situ (FISH), a reacção em cadeia da polimerase (PCR), bem como melhorias nos diversos métodos laboratoriais a utilizar.

Quanto aos elementos técnicos das medidas de controlo, introduzem-se disposições que permitem melhorar a forma de conservação das amostras testadas, no sentido de assegurar a rastreabilidade do organismo prejudicial, a reunião dos elementos necessários para determinar a dimensão provável da contaminação, os pormenores da notificação de qualquer presença confirmada do organismo prejudicial e da zona contaminada relevante e a aplicação das medidas em locais de produção designados como contaminados e no interior das zonas demarcadas.

Deste modo, face à obrigatoriedade de proceder à transposição da Directiva n.º 2006/63/CE, da Comissão, de 14 de Julho, aliada ao facto de ser necessário actualizar, por um lado, não só todo o regime específico de medidas fitossanitárias aplicáveis mas também as referências aos serviços oficiais com competências na matéria, e por outro, enquadrar tais disposições com o actual regime fitossanitário aprovado pelo Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro, importa que se opte por publicar um decreto-lei que comporte a consolidação legislativa de toda a matéria em apreço, revogando, em consequência, o citado Decreto-Lei n.º 494/99, de 18 de Novembro.

Foram ouvidos os órgãos de governo próprio das Regiões Autónomas.

Foi promovida a audição do Conselho Nacional do Consumo.

Assim:

Nos termos da alínea a) do n.º 1 do artigo 198.º da Constituição, o Governo decreta o seguinte:

CAPÍTULO I

Disposições gerais

Artigo 1.º

Transposição de directivas

O presente decreto-lei transpõe para a ordem jurídica interna a Directiva n.º 2006/63/CE, da Comissão, de 14 de Julho, que altera os anexos II a VII da Directiva n.º 98/57/CE, do Conselho, de 20 de Julho, relativa ao controlo de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., procedendo, simultaneamente, à consolidação legislativa da transposição de ambas as directivas.

Artigo 2.º

Objecto

1 - O presente decreto-lei estabelece as medidas de controlo fitossanitário a adoptar em relação à bactéria Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., causadora da doença do pus ou mal murcho da batateira e do mal murcho tomateiro, a seguir designada por organismo prejudicial, no sentido de evitar o seu aparecimento, e, uma vez detectada, localizá-la e determinar a sua distribuição, evitar a sua dispersão e combatê-la com vista à sua eventual erradicação.

2 - O disposto no presente decreto-lei é aplicável, sem prejuízo do disposto no Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro, que actualiza o regime fitossanitário que cria e define as medidas de protecção fitossanitária destinadas a evitar a introdução e dispersão no território nacional e comunitário, incluindo nas zonas protegidas, de organismos prejudiciais aos vegetais e produtos vegetais qualquer que seja a sua origem ou proveniência.

CAPÍTULO II

Controlo do organismo prejudicial

Artigo 3.º

Prospecção oficial

1 - Para efeitos do disposto no número anterior, a Direcção-Geral da Agricultura e Desenvolvimento Rural (DGADR) define, elabora e coordena a aplicação do programa nacional de prospecção do organismo prejudicial, cuja execução se realiza anualmente.

2 - A execução do programa de prospecção referido no número anterior cabe aos serviços de inspecção fitossanitária das direcções regionais de agricultura e pescas (DRAP) e dos correspondentes organismos das Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira, nas respectivas áreas de actuação.

3 - As prospecções previstas no programa nacional são realizadas em conformidade com o disposto no n.º 1 da secção II do anexo I do presente decreto-lei, que dele faz parte integrante, e incidem obrigatoriamente sobre as plantas constantes da lista a que se refere a secção I do anexo I, a seguir designadas por materiais vegetais.

4 - De acordo com a avaliação do risco de dispersão do organismo prejudicial efectuada no decurso da execução do programa referido no n.º 1, as prospecções podem ser realizadas, utilizando métodos adequados, em zonas de produção de batata, tomate e outras solanáceas e em viveiros de tomateiro, assim como em locais de transformação industrial e centros de embalagem.

5 - Igualmente de acordo com a avaliação do risco de dispersão do organismo prejudicial efectuada no decurso da execução do programa referido no n.º 1, as prospecções podem ainda incidir sobre outras plantas solanáceas, para além dos materiais vegetais, e infestantes da mesma família, águas superficiais utilizadas para rega dos materiais vegetais, resíduos líquidos de descarga e resíduos sólidos provenientes de instalações de transformação industrial de batata e tomate ou de embalagem de batata, meios de cultura e solo, a seguir designados por outros materiais, recorrendo a métodos adequados, e, quando necessário, com colheita de amostras que são submetidas a testes laboratoriais oficiais ou oficialmente controlados.

6 - O método de diagnóstico, detecção e identificação do organismo prejudicial nos materiais vegetais é o referido no anexo II do presente decreto-lei, que dele faz parte integrante, devendo ser utilizado, nos outros materiais, qualquer outro método adequado oficialmente aprovado.

7 - A DGADR deve comunicar anualmente à Comissão Europeia e aos demais Estados membros os resultados da execução do programa nacional de prospecção do organismo prejudicial, em conformidade com o disposto no n.º 2 da secção II do anexo I.

Artigo 4.º

Dever de informação em relação ao organismo prejudicial

Qualquer pessoa que saiba ou suspeite da presença do organismo prejudicial em qualquer dos materiais vegetais ou nos outros materiais deve informar de imediato os serviços de inspecção fitossanitária das DRAP ou a DGADR.

Artigo 5.º

Procedimentos no caso de suspeita da presença

do organismo prejudicial

1 - Considera-se estar perante uma ocorrência suspeita quando a confirmação da presença do organismo prejudicial se tenha verificado por meio de:

a) Observação de sintomas de diagnóstico da doença causada pelo organismo prejudicial e se obteve um resultado positivo no ou nos testes rápidos de rastreio, definidos no n.º 1 da secção I e na secção II do anexo II; ou

b) Obtenção de um resultado positivo no ou nos testes de rastreio definidos no n.º 2 da secção I e na secção III do anexo II.

2 - Em caso de ocorrência suspeita, os serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente devem:

a) Assegurar a realização de testes laboratoriais oficiais ou oficialmente controlados, conforme previsto no n.º 6 do artigo 3.º, de acordo com as condições definidas no n.º 1 do anexo III do presente decreto-lei, do qual faz parte integrante, a fim de confirmar ou refutar a ocorrência suspeita;

b) Proibir a utilização e a circulação de plantas ou tubérculos de todas as colheitas, lotes ou remessas em que tenham sido colhidas amostras, excepto sob o seu controlo e desde que se tenha concluído que não existe qualquer risco identificável de dispersão do organismo prejudicial;

c) Adoptar medidas adicionais a fim de determinar a origem da ocorrência suspeita e evitar a dispersão do organismo prejudicial.

3 - Nos casos de ocorrência suspeita relativamente à qual existam riscos de contaminação dos materiais vegetais ou das águas superficiais de ou para outro Estado membro, a DGADR deve comunicar imediatamente, de acordo com o risco identificado, os organismos responsáveis dos Estados membros em causa, bem como a Comissão Europeia, dos dados relativos à citada ocorrência suspeita.

Artigo 6.º

Procedimentos no caso de confirmação da presença

do organismo prejudicial

1 - Sempre que a presença do organismo prejudicial seja confirmada através dos testes laboratoriais referidos no n.º 6 do artigo 3.º, os serviços de inspecção fitossanitária da DRA competente devem:

a) Zelar pelo cumprimento dos procedimentos estabelecidos no n.º 2 do anexo III;

b) No que respeita aos materiais vegetais:

i) Proceder a investigações para determinar a extensão e a ou as fontes primárias da contaminação, de acordo com o disposto no anexo IV do presente decreto-lei, do qual faz parte integrante, por meio de análises adicionais em conformidade com o disposto no n.º 6 do artigo 3.º, em, pelo menos, todos os lotes de batata-semente com uma relação clonal;

ii) Declarar contaminados os materiais vegetais, remessas e ou lotes em que tenha sido colhida a amostra, bem como as máquinas, veículos, recipientes, armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, incluindo material de embalagem, que tenham estado em contacto com os materiais vegetais em que tenha sido colhida a amostra, declarar igualmente contaminados, quando for necessário, os campos, unidades de produção de culturas protegidas e locais de cultura em que tenham sido colhidos os materiais vegetais e de que provém a amostra, declarar também contaminados, no caso de amostras colhidas durante a época de cultura, os campos, locais de produção e, quando necessário, unidades de produção de culturas protegidas em que tenha sido colhida a amostra;

iii) Determinar, em conformidade com o disposto no n.º 1 do anexo V do presente decreto-lei, do qual faz parte integrante, a extensão da contaminação provável por contacto pré ou pós-colheita ou por relação de produção, irrigação ou relação clonal com a contaminação declarada; e

iv) Demarcar uma zona com base na declaração de contaminação, na determinação da extensão da contaminação provável e na possível dispersão do organismo prejudicial, em conformidade com o disposto na alínea i) do n.º 2 do anexo V;

c) Para as culturas de plantas hospedeiras diferentes das referidas na alínea anterior, quando considerarem que está em risco a produção dos materiais vegetais:

i) Proceder a investigações nos termos da subalínea i) da alínea anterior;

ii) Declarar contaminadas as plantas hospedeiras do organismo prejudicial em que tenha sido colhida a amostra; e

iii) Determinar a contaminação provável e demarcar uma zona nos termos das subalíneas iii) e iv) da alínea anterior, respectivamente, em relação à produção dos materiais vegetais;

d) Para as águas superficiais, incluindo resíduos líquidos de descarga de instalações de transformação industrial ou de embalagem que lidem com os materiais vegetais, e para solanáceas silvestres hospedeiras, quando considerarem que está em risco a produção dos materiais vegetais, por via da irrigação, aspersão ou inundação por águas superficiais:

i) Proceder a investigações, incluindo uma prospecção oficial, nos momentos adequados, em amostras de águas superficiais e de solanáceas silvestres hospedeiras, caso presentes, por forma a determinar a extensão da contaminação; e

ii) Declarar contaminadas as águas superficiais em que tenha ou tenham sido colhidas as amostras, na medida em que tal seja apropriado e no seguimento das investigações referidas na subalínea anterior; e

iii) Determinar a contaminação provável e demarcar uma zona, com base na declaração de contaminação, ao abrigo da subalínea anterior, e na possibilidade de dispersão do organismo prejudicial, tendo em conta o disposto no n.º 1 e na alínea ii) do n.º 2 do anexo V.

2 - A DGADR deve comunicar à Comissão Europeia e aos restantes Estados membros qualquer contaminação declarada:

a) Nos termos das subalíneas ii) da alínea b) e ii) da alínea d) do número anterior;

b) Dos pormenores respeitantes à demarcação da zona nos termos da subalínea iv) da alínea b) do número anterior;

c) Quando aplicável, dos pormenores respeitantes à demarcação da zona nos termos da subalínea iii) da alínea d) do número anterior, nos termos do disposto no n.º 3 do anexo V.

3 - A comunicação referida no número anterior é acompanhada da comunicação adicional prevista no n.º 4 do anexo V.

Artigo 7.º

Medidas de protecção fitossanitária subsequentes

1 - Os materiais vegetais declarados contaminados não podem ser plantados e sob controlo e aprovação dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente são sujeitos a um dos processos indicados no n.º 1 do anexo VI e do anexo VII do presente decreto-lei, do qual fazem parte integrante, em condições que garantam que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo prejudicial.

2 - Os materiais vegetais declarados como provavelmente contaminados, incluindo os materiais vegetais que tenham sido considerados em risco, produzidos em locais de cultura declaradas como provavelmente contaminadas, não podem ser plantados e, sob controlo dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente, são utilizados de forma adequada ou eliminados conforme especificado no n.º 2 do anexo VI, em condições que garantam que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo prejudicial.

3 - Toda a maquinaria, veículos, recipientes, armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, incluindo o material de embalagem declarados contaminados, ou considerados como provavelmente contaminados, são destruídos ou descontaminados segundo métodos adequados conforme especificado no n.º 3 do anexo VI, sendo após a descontaminação esses objectos deixam de ser considerados contaminados.

4 - Sem prejuízo das medidas aplicadas nos termos dos números anteriores, na zona demarcada, são, também, aplicadas as medidas especificadas nos n.os 4.1 e 4.2 do anexo VI.

5 - Só é permitida a plantação de batata-semente desde que:

a) Sejam satisfeitas as exigências estabelecidas no Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro;

b) A batata seja proveniente, em linha directa, de material obtido no âmbito de um programa oficialmente aprovado que tenha sido declarado isento do organismo prejudicial em testes oficiais ou controlados oficialmente, utilizando o método referido no n.º 6 do artigo 4.º

6 - Os testes referidos na alínea b) do número anterior devem ser realizados:

a) Quando tiver sido comprovada a presença do organismo prejudicial na própria produção de batata-semente:

i) Através de análises de todo o material de propagação anterior, incluindo a selecção clonal inicial, e de análises sistemáticas de todos os clones de batata-semente de base; ou

ii) Quando tiver sido determinado que não existe relação clonal inicial, através de análises de todos os clones de batata-semente de base ou de material de propagação anterior, incluindo a selecção clonal inicial;

b) Nos restantes casos ou em todas as plantas de selecção clonal inicial ou em amostras representativas da batata-semente base ou de material de propagação anterior.

Artigo 8.º

Notificação das medidas fitossanitárias

As medidas de protecção fitossanitária determinadas e mandadas aplicar são objecto de notificações oficiais emanadas das DRAP, dirigidas às pessoas singulares e colectivas envolvidas.

Artigo 9.º

Encargos dos operadores económicos

Os encargos resultantes da aplicação das medidas de protecção fitossanitária referidas no número anterior são suportados pelos respectivos operadores económicos.

Artigo 10.º

Proibição

É proibida a posse e manuseamento do organismo prejudicial.

Artigo 11.º

Derrogações

Para fins experimentais ou científicos e trabalhos de selecção varietal, a DGADR pode autorizar a não execução do disposto nos n.os 1 a 4 do artigo 7.º e no artigo 10.º, para efeitos de aplicação do Decreto-Lei n.º 91/98, de 14 de Abril, que estabelece as condições pelas quais determinados organismos prejudiciais, vegetais, produtos vegetais e outros materiais podem ser introduzidos ou circular na Comunidade ou em zonas protegidas para fins experimentais ou científicos e trabalhos de selecção de variedades.

CAPÍTULO III

Regime contra-ordenacional

Artigo 12.º

Contra-ordenações

1 - As seguintes infracções constituem contra-ordenações puníveis com coima cujo montante mínimo é de (euro) 100 e máximo de (euro) 3740 ou mínimo de (euro) 250 e máximo de (euro) 44890, consoante o agente seja pessoa singular ou colectiva:

a) A omissão do dever de informação previsto no artigo 4.º;

b) O não cumprimento das medidas de protecção fitossanitária determinadas e mandadas aplicar ao abrigo do artigo 8.º e em violação do disposto nos artigos 5.º e 7.º;

c) O não cumprimento dos encargos financeiros resultantes da aplicação das medidas de protecção fitossanitária a aplicar ao abrigo do artigo 8.º, em violação do disposto no artigo 9.º;

d) A posse e o manuseamento do organismo prejudicial, em violação do disposto no artigo 10.º

2 - A tentativa e a negligência são puníveis, sendo nesse caso reduzidos para metade os limites mínimos e máximos referidos no número anterior.

Artigo 13.º

Sanções acessórias

1 - Em função da gravidade da infracção e da culpa do agente, podem ser aplicadas, simultaneamente com as coimas, as seguintes sanções acessórias:

a) Perda de objectos pertencentes ao agente;

b) Interdição do exercício de profissões ou actividades cujo exercício dependa de título público ou de autorização ou de homologação de autoridade pública;

c) Privação do direito a subsídio ou benefício outorgado por entidades ou serviços públicos;

d) Privação do direito de participar em feiras ou mercados;

e) Encerramento de estabelecimento cujo funcionamento esteja sujeito a autorização de autoridade administrativa;

f) Suspensão de autorizações.

2 - As sanções previstas no número anterior têm a duração máxima de um ano.

3 - No caso de uma conduta contra-ordenacional ter ocasionado um grave risco de propagação do organismo prejudicial, deve ser dada publicidade à decisão condenatória definitiva de aplicação da coima, mediante a afixação de editais na sede da DRA da área onde foi praticada a infracção.

Artigo 14.º

Processos de contra-ordenação

Sem prejuízo das competências atribuídas por lei às autoridades policiais e fiscalizadoras, o levantamento dos autos e a instrução dos processos de contra-ordenação são da competência da DRAP da região em cuja área foi praticada a contra-ordenação, competindo ao director-geral da Agricultura e Desenvolvimento Rural a aplicação das coimas e sanções acessórias.

Artigo 15.º

Produto das coimas

O produto das coimas reverte:

a) Em 10% para a entidade que levantou o auto de contra-ordenação;

b) Em 10% para a entidade que instruiu o processo;

c) Em 20% para a entidade que aplicou a coima;

d) Em 60% para o Estado.

CAPÍTULO IV

Disposições finais

Artigo 16.º

Aplicação às Regiões Autónomas

1 - Sem prejuízo das competências atribuídas à DGADR na qualidade de autoridade fitossanitária nacional, as competências atribuídas pelo presente decreto-lei às DRAP são exercidas nas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira pelos organismos dos departamentos regionais competentes.

2 - As competências previstas no artigo 14.º são exercidas nas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira pelos organismos definidos pelos órgãos de governo próprio.

3 - As percentagens previstas no artigo 15.º provenientes das coimas aplicadas nas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira constituem receita própria de cada uma delas.

Artigo 17.º

Norma revogatória

É revogado o Decreto-Lei n.º 494/99, de 18 de Novembro.

Artigo 18.º

Remissão

Todas as referências feitas para o decreto-lei que agora se revoga consideram-se feitas para o presente decreto-lei.

Visto e aprovado em Conselho de Ministros de 3 de Maio de 2007. - José Sócrates Carvalho Pinto de Sousa - Luís Filipe Marques Amado - Fernando Teixeira dos Santos - Alberto Bernardes Costa - Francisco Carlos da Graça Nunes Correia - Manuel António Gomes de Almeida de Pinho - Jaime de Jesus Lopes Silva.

Promulgado em 11 de Junho de 2007.

Publique-se.

O Presidente da República, ANÍBAL CAVACO SILVA.

Referendado em 14 de Junho de 2007.

O Primeiro-Ministro, José Sócrates Carvalho Pinto de Sousa.

ANEXO I

SECÇÃO I

Lista de vegetais hospedeiros de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

1 - Plantas (incluindo tubérculos, com excepção da semente verdadeira, de Solanum tuberosum L. (Batata).

2 - Plantas, com excepção de frutos e sementes de Lycopersicon Lycopersicum (L.) Karsten ex Farw. (Tomate).

SECÇÃO II

Prospecções

1 - As prospecções oficiais referidas no n.º 3 do artigo 3.º, são baseadas na biologia do organismo prejudicial e nos sintomas de produção específica do País, devendo incluir:

1.1 - No caso da batata:

a) Em alturas apropriadas, inspecção visual da cultura em desenvolvimento e ou colheita de amostras de batata-semente e de batata consumo durante a época de cultura ou em armazém, sendo que essas amostras são sujeitas a uma inspecção visual oficial ou oficialmente controlada, com corte dos tubérculos; e

b) No caso da batata-semente e, quando apropriado, da batata consumo, análises laboratoriais oficiais ou oficialmente controladas, utilizando o método constante do anexo II.

1.2 - No caso do tomate, inspecção visual em alturas apropriadas, pelo menos da cultura em desenvolvimento de plantas destinadas a replantação para utilização profissional.

2 - A comunicação das prospecções oficiais, a que se refere o n.º 7 do artigo 3.º, deve incluir:

2.1 - No caso de prospecções em batata:

a) Estimativa da superfície total de cultura de batata-sememte e de batata consumo, em hectares;

b) Descriminação por categoria de semente e calibre e, quando apropriado por região;

c) Número e data das amostras colhidas para análise;

d) Número de inspecções visuais da cultura;

e) Número (e dimensão da amostra) de inspecções visuais de tubérculos.

2.2 - No caso de prospecções, pelo menos na cultura em desenvolvimento, de plantas de tomateiro destinadas a replantação para utilização profissional:

a) Estimativa do número total de plantas;

b) Número de inspecções visuais.

2.3 - No caso de prospecções noutras plantas hospedeiras, incluindo solanáceas silvestres hospedeiras:

a) Espécie;

b) Número e data das amostras colhidas;

c) Área/rio, consoante o caso, em que foram colhidas as amostras;

d) Método analítico.

2.4 - No caso de prospecções em águas e descargas de resíduos líquidos provenientes de instalações de transformação industrial ou de embalagem:

a) Número e data das amostras colhidas;

b) Área/rio/situação das instalações, consoante o caso, em que foram colhidas as amostras;

c) Método analítico.

ANEXO II

Esquema de ensaio para diagnóstico, detecção e identificação de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., para efeitos do presente anexo designada por R. solanacearum.

Âmbito do esquema de ensaio

O esquema de ensaio apresentado descreve os vários procedimentos envolvidos:

i) No diagnóstico do pus em tubérculos de batateira e de mal murcho em plantas de batateira, de tomateiro e outras plantas hospedeiras;

ii) Na detecção de R. solanacearum em amostras de tubérculos de batateira, em plantas de batateira, de tomateiro e outras plantas hospedeiras, em água e no solo;

iii) Na identificação de R. solanacearum.

Princípios gerais:

Nos apêndices são apresentados os protocolos optimizados para os diversos métodos, reagentes validados e pormenores respeitantes à preparação dos materiais para realização dos testes e dos controlos. No apêndice n.º 1 é fornecida uma lista dos laboratórios incluídos na optimização e validação de protocolos.

Uma vez que os protocolos envolvem a detecção de um organismo de quarentena e incluem a utilização de culturas viáveis de R. solanacearum como materiais de controlo, é necessário realizar os procedimentos em condições de quarentena adequadas, em instalações com sistemas apropriados de eliminação de resíduos e possuindo as licenças adequadas, emitidas pelas autoridades oficiais competentes em matéria de quarentena fitossanitária.

Os parâmetros dos ensaios devem garantir a detecção consistente e reprodutível de níveis de R. solanacearum nos limiares estabelecidos para os métodos seleccionados.

É imperiosa a preparação rigorosa de controlos positivos.

A realização dos ensaios de acordo com os limiares exigidos implica igualmente uma regulação, manutenção e calibração correctas do equipamento, uma manipulação e conservação cuidadosas dos reagentes e estabelecimento de todas as medidas destinadas a evitar contaminações entre amostras, por exemplo, a separação de controlos positivos das amostras a testar. Devem ser aplicadas normas de controlo de qualidade a fim de evitar, nomeadamente, erros administrativos, em especial no tocante à rotulagem e à documentação.

Uma ocorrência suspeita, conforme referido no n.º 1 do artigo 5.º do presente decreto-lei, implica um resultado positivo nos testes de diagnóstico ou de rastreio efectuados numa amostra, conforme especificado nos fluxogramas a seguir indicados. Um primeiro teste de rastreio positivo (teste IF, PCR/FISH, isolamento selectivo) deve ser confirmado por um segundo teste de rastreio baseado num princípio biológico diferente.

Caso o primeiro teste de rastreio seja positivo, suspeita-se, então, de contaminação por R. solanacearum, devendo proceder-se a um segundo teste de rastreio. Caso o segundo teste de rastreio seja positivo, é confirmada a suspeita (ocorrência suspeita), devendo prosseguir-se a verificação de acordo com o esquema. Caso o segundo teste de rastreio seja negativo, considera-se então que a amostra não está contaminada por R. solanacearum.

A presença confirmada, conforme referido no no n.º 1 do artigo 6.º do presente decreto-lei, implica o isolamento e a identificação de uma cultura pura de R. solanacearum com confirmação de patogenicidade.

SECÇÃO I

Aplicação do esquema de ensaio

1 - Esquema para o diagnóstico do pus ou mal murcho (R. solanacearum) em tubérculos de batateira e em plantas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sintomas:

O procedimento laboratorial destina-se a tubérculos de batateira e a plantas com sintomas típicos ou suspeitos de pus ou mal murcho. Implica um teste rápido de rastreio, isolamento do patogéneo a partir do tecido vascular infectado num meio de cultura (selectivo) e, em caso de resultado positivo, identificação da cultura como R. solanacearum.

(ver documento original)

2 - Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de tubérculos de batateira assintomáticos:

Princípio:

O procedimento laboratorial destina-se a detectar infecções latentes em tubérculos de batateira. Um resultado positivo em, pelo menos, dois testes de rastreio (3), com base em princípios biológicos diferentes, deve ser complementado com o isolamento do patogéneo, seguido, em caso de isolamento de colónias típicas, de confirmação da identificação da cultura pura como sendo R. solanacearum. Um resultado positivo em apenas um dos testes de rastreio não é suficiente para considerar a amostra suspeita.

Os testes de rastreio e os testes de isolamento devem permitir detectar 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células por ml de sedimento ressuspenso, incluídos como controlos positivos em cada série de testes.

(ver documento original)

3 - Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de plantas assintomáticas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras:

(ver documento original)

SECÇÃO II

Métodos pormenorizados de detecção de R. Solanacearum em tubérculos de batateira e em plantas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sintomas de pus ou mal murcho

1 - Sintomas (ver http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main):

1.1 - Sintomas em batateira:

Planta de batateira:

Na fase inicial de infecção no campo, verifica-se uma murchidão das folhas na parte superior da planta a temperaturas elevadas e durante o dia, com recuperação à noite. Na fase inicial de murchidão, as folhas mantêm-se verdes mas, posteriormente, desenvolve-se uma clorose seguida de necrose. Observa-se também epinastia. A murchidão de um rebento ou de toda a planta torna-se rapidamente irreversível, resultando no colapso e na morte da planta. O tecido vascular dos caules de plantas afectadas cortados transversalmente apresenta-se necrosado e um exsudado bacteriano de cor esbranquiçada emerge da superfície cortada ou pode ser extraído apertando o caule entre os dedos. Quando um caule cortado é colocado verticalmente em água, observa-se a exsudação de um líquido viscoso a partir dos feixes vasculares.

Tubérculo de batateira:

Os tubérculos de batateira têm que ser cortados transversalmente junto do hilo (extremidade do estolho) ou longitudinalmente sobre a extremidade do estolho. Na fase inicial de infecção, verifica-se uma coloração amarela vítrea ou castanha clara no anel vascular, pelo qual emerge espontaneamente, após alguns minutos, um exsudado bacteriano de cor creme clara. Mais tarde, a descoloração vascular assume um tom castanho mais nítido e a necrose pode alastrar ao parênquima. Nas fases mais avançadas, a infecção progride a partir do hilo e dos «olhos», nos quais se pode manifestar exsudação bacteriana que origina a adesão de partículas de terra. Podem apresentar-se lesões na epiderme de cor vermelha acastanhada, em ligeira depressão, por colapso interno dos tecidos vasculares. Nas fases avançadas da doença, é comum o desenvolvimento de podridões moles secundárias causadas por fungos ou bactérias.

1.2 - Sintomas no tomateiro:

Planta de tomateiro:

Os primeiros sintomas visíveis são o aspecto flácido das folhas mais jovens. Em condições ambientais favoráveis ao patogéneo (temperatura do solo de 25ºC, humidade saturada), surge dentro de poucos dias a epinastia e a murchidão de um lado ou de toda a planta, conduzindo ao total colapso da planta. Em condições menos favoráveis (temperatura do solo inferior a 21ºC), observa-se uma menor murchidão, mas pode desenvolver-se no caule um grande número de raízes adventícias. Podem observar-se manchas hidrópicas alongadas a partir da base do caule, que evidenciam a necrose do sistema vascular. Quando o caule é cortado transversalmente, os seus tecidos vasculares apresentam uma coloração acastanhada e exsudam gotas de líquido viscoso branco ou amarelado, que contêm células bacterianas.

1.3 - Sintomas noutros hospedeiros:

Plantas de Solanum dulcamara e S. nigrum:

Em condições naturais, os sintomas de murchidão são raramente observados nestas infestantes hospedeiras, a menos que as temperaturas do solo ultrapassemos 25ºC ou que os níveis de inóculo sejam extremamente elevados (por exemplo, no caso de S. nigrum que cresce junto de plantas de batateira ou de tomateiro doentes). Quando efectivamente ocorre a murchidão, os sintomas são iguais aos descritos para o tomateiro. As plantas de S. dulcamara que não apresentam murchidão e com os caules e raízes imersos em água podem apresentar uma coloração castanha clara dos tecidos vasculares em secções transversais da base do caule ou de outras partes do caule que se encontrem submersas. Mesmo na ausência de sintomas de murchidão, pode manifestar-se a presença de exsudado bacteriano a partir de cortes de tecido vascular ou observar-se esse exsudado se o caule, cortado transversalmente, for colocado verticalmente em água.

2 - Testes rápidos de rastreio:

Os testes rápidos de rastreio podem facilitar o diagnóstico preliminar, mas não são essenciais. Utilizar um ou mais dos seguintes testes validados:

2.1 - Teste de exsudação do caule (ver n.º 1 da parte A da secção VI.).

2.2 - Detecção de grânulos de poli-â-hidroxibutirato (PHB):

Os grânulos característicos de PHB nas células de R. solanacearum são visualizados através da coloração com azul de Nilo A ou com negro de Sudão de esfregaços de exsudado bacteriano provenientes de tecido vegetal infectado fixados pelo calor numa lâmina de microscópio (ver n.º 2 da parte A da secção VI).

2.3 - Testes serológicos de aglutinação (ver n.º 3 da parte A da secção VI.).

2.4 - Outros testes:

Outros testes rápidos de rastreio considerados apropriados são o teste IF (ver n.º 5 da parte A da secção VI), o teste FISH (ver n.º 7 da parte A da secção VI), os testes ELISA (ver n.º 8 da parte A da secção VI) e os testes PCR (ver n.º 6 da parte A da secção VI).

3 - Isolamento:

a) Retirar o exsudado ou secções do tecido necrosado do anel vascular do tubérculo ou da zona vascular do caule da planta de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sintomas de murchidão. Efectuar uma suspensão num pequeno volume de água destilada esterilizada ou de tampão fosfato 50 mM (apêndice n.º 4) e deixar em repouso durante 5 a 10 minutos;

b) Preparar uma série de diluições decimais da suspensão;

c) Transferir 50-100 (mi)l da suspensão para um meio nutritivo geral (NA, YPGA ou SPA, ver apêndice n.º 2) e ou para o meio de tetrazólio de Kelman (apêndice n.º 2) e ou para um meio selectivo validado (por exemplo, SMSA, ver apêndice n.º 2). Espalhar ou efectuar um reticulado com uma técnica adequada de diluição em placas. Se necessário, preparar um conjunto separado de placas com uma suspensão diluída de células de R. solanacearum Biovar 2 como controlo positivo;

d) Incubar as placas durante 2 a 6 dias a 28ºC:

Em meios nutritivos gerais, os isolados virulentos de R. solanacearum produzem colónias de cor branco-pérola, achatadas, irregulares e fluidas, exibindo muitas vezes espirais características no centro. Formas avirulentas de R. solanacearum apresentam pequenas colónias butirosas redondas e não fluidas de coloração esbranquiçada;

Nos meios de tetrazólio de Kelman e SMSA, as espirais são de cor vermelha viva. As formas avirulentas de R. solanacearum apresentam pequenas colónias butirosas redondas e não fluidas que são completamente vermelho-escuras.

4 - Testes de identificação de R. solanacearum:

Testes para confirmar a identidade de presumíveis isolados de R. solanacearum são descritos na parte B da secção VI.

SECÇÃO III

1 - Métodos pormenorizados de detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de tubérculos de batateira assintomáticos:

1.1 - Preparação da amostra:

Nota. - A dimensão normal da amostra é de 200 tubérculos por teste. Uma amostragem mais intensiva exige a realização de mais testes em amostras desta dimensão. Uma amostra com um maior número de tubérculos conduzirá à incapacidade ou a uma maior dificuldade de interpretação dos resultados. Contudo, este procedimento pode ser aplicado a amostras com menos de 200 tubérculos, sempre que este número de tubérculos não se encontre disponível.

A validação de todos os métodos de detecção abaixo descritos tem por base a análise de amostras constituídas por 200 tubérculos.

O extracto de batata descrito em seguida pode também ser utilizado para a detecção da bactéria Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, responsável pela podridão anelar da batateira.

Pré-tratamento opcional antes da preparação da amostra:

a) Incubação de amostras a uma temperatura de 25-30 C durante um período de até 2 semanas, para favorecer a multiplicação de populações de R. solanacearum;

b) Lavar os tubérculos. Utilizar desinfectantes (compostos de cloro sempre que se utilizar o teste PCR para destruir ADN de organismos saprófitas) e detergentes adequados entre cada amostra. Secar os tubérculos ao ar. Este procedimento de lavagem é particularmente útil (mas não obrigatório) para amostras que apresentem um excesso de terra e quando se pretende realizar um teste PCR ou um isolamento directo.

1.1.1 - Remover a epiderme na zona do hilo de cada tubérculo com um bisturi ou faca de cortar legumes, limpos e desinfectados, de forma que o tecido vascular fique visível. Retirar cuidadosamente um pequeno cone de tecido vascular na zona do hilo, reduzindo ao mínimo a quantidade de tecido não vascular (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Nota. - Pôr de lado quaisquer tubérculos (com podridões) que exibam sintomas suspeitos de pus analisá-los separadamente.

Caso se observem sintomas suspeitos de pus durante a remoção do cone da zona do hilo, deve proceder-se a uma inspecção visual do tubérculo em questão e este deverá ser cortado próximo do hilo. Qualquer tubérculo cortado exibindo sintomas suspeitos deve ser mantido durante, pelo menos, dois dias à temperatura ambiente, no sentido de permitir a suberização, e em seguida armazenado numa área refrigerada (entre 4 a 10ºC) em condições de quarentena adequadas. Todos os tubérculos, incluindo os que apresentam sintomas suspeitos, devem ser conservados de acordo com o anexo III.

1.1.2 - Colocar os cones dos hilos em recipientes descartáveis não utilizados que possam ser fechados e ou selados (caso os recipientes sejam reutilizados devem ser cuidadosamente limpos e desinfectados com compostos de cloro). Os cones dos hilos devem ser, de preferência, processados de imediato. Se tal não for possível, devem ser mantidos no recipiente, sem adição de tampão, em local refrigerado durante, no máximo, 72 horas, ou 24 horas à temperatura ambiente.

Processar os cones dos hilos de acordo com um dos seguintes procedimentos:

a) Cobrir os cones com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice n.º 4) e colocá-los num agitador rotativo (50-100 rpm) durante 4 horas a uma temperatura inferior a 24ºC, ou durante 16-24 horas refrigerados; ou

b) Homogeneizar os cones com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice n.º 4) num misturador (por exemplo, Waring Blender ou Ultra Thurrax) ou por esmagamento num saco de maceração descartável selado (por exemplo, Stomacher ou Bioreba, em polietileno resistente, de 150 mm x 250 mm, esterilizado por radiação) utilizando um macete de borracha ou um instrumento de trituração adequado (por exemplo, Homex).

Nota. - O risco de contaminação cruzada das amostras é elevado quando estas são homogeneizadas com recurso a um misturador. Tomar as precauções necessárias para evitar a formação de aerossóis ou derrames durante o processo de extracção. Assegurar-se de que as lâminas e os recipientes do misturador utilizados para cada amostra foram recentemente esterilizados. Caso se utilize o teste PCR, evitar a contaminação por ADN dos recipientes ou instrumento de trituração. Sempre que se utilize o teste PCR, recomenda-se a trituração em sacos descartáveis e a utilização de tubos descartáveis.

1.1.3 - Decantar o sobrenadante. Caso se encontre excessivamente turvo, clarificar através de centrifugação a baixa velocidade (a não mais de 180 g durante 10 minutos a uma temperatura entre 4 e 10ºC) ou de filtração por vácuo (40-100 (mi)m), lavando o filtro com tampão de extracção adicional (10 ml).

1.1.4 - Concentrar a fracção bacteriana por centrifugação a 7000 g durante 15 minutos (ou 10000 g durante 10 minutos) a uma temperatura entre 4 e 10ºC e desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.

1.1.5 - Ressuspender o sedimento em 1,5 ml de tampão de ressuspensão (apêndice n.º 4). Utilizar 500 (mi)l para R. solanacearum, 500 (mi)l para Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus e 500 (mi)l para fins de referência. Adicionar glicerol esterilizado até obter uma concentração final de 10-25% (v/v) aos 500 (mi)l das alíquotas de referência e à alíquota remanescente da amostra em estudo; agitar em vortex e armazenar entre -16 e -24ºC (semanas) ou entre 68 e 86ºC (meses). Manter a alíquota remanescente da amostra em estudo a uma temperatura entre 4 e 10ºC durante o período de ensaio.

Não se aconselha a congelação e descongelação repetidas.

Caso seja necessário transportar o extracto, garantir a entrega numa caixa refrigerada num prazo de 24 a 48 horas.

1.1.6 - É indispensável que todas as amostras e controlos positivos de R. solanacearum sejam tratados separadamente para evitar contaminações. O mesmo se aplica às lâminas de imunofluorescência e a todos os testes.

1.2 - Ensaio:

Ver fluxograma e descrição dos testes e protocolos optimizados nos respectivos apêndices:

Isolamento selectivo (ver n.º 4 da parte A da secção VI);

Teste IF (ver n.º 5 da parte A da secção VI);

Testes PCR (ver n.º 6 da parte A da secção VI);

Teste FISH (ver n.º 7 da parte A da secção VI);

Testes ELISA (ver n.º 8 da parte A da secção VI);

Bioensaio (ver n.º 9 da parte A da secção VI).

2 - Métodos pormenorizados de detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de plantas assintomáticas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras:

2.1 - Preparação da amostra:

Nota. - Para a detecção de populações latentes de R. solanacearum, é aconselhável a análise de amostras compostas. O procedimento pode ser aplicado convenientemente a amostras compostas contendo até 200 partes de caule. Sempre que forem realizadas prospecções, estas devem basear-se numa amostra estatisticamente representativa da população de plantas em estudo.

2.1.1 - Recolher segmentos de caule de 1-2 cm num recipiente esterilizado fechado, de acordo com os seguintes procedimentos de amostragem:

Plântulas de tomateiro de viveiro:

Com uma faca limpa e desinfectada, remover um segmento de 1 cm da base de cada caule, imediatamente acima do nível do solo.

Plantas de tomateiro cultivadas no campo ou em estufa:

Com uma faca limpa e desinfectada, remover o rebento lateral inferior de cada planta, cortando-o imediatamente acima do ponto de junção com o caule principal. Remover o segmento inferior de 1 cm de cada rebento lateral.

Outros hospedeiros:

Com uma faca ou uma tesoura de poda limpas e desinfectadas, remover um segmento de 1 cm da base de cada caule, imediatamente acima do nível do solo. No caso da S. dulcamara ou de outras plantas hospedeiras aquáticas, retirar secções de 1-2 cm dos caules ou estolhos que se encontrem submersos com raízes aquáticas.

Ao colher amostras de um determinado local, recomenda-se a análise de uma amostra estatisticamente representativa de, pelo menos, 10 plantas de cada potencial hospedeiro infestante por ponto de amostragem. A detecção do patogéneo será mais fiável no final da Primavera, no Verão e no Outono, embora se possam detectar infecções naturais durante todo o ano em S. dulcamara perene que cresce em cursos de água. Alguns hospedeiros conhecidos incluem plantas da batateira espontâneas (zorras), S. dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium e outros membros da família Solanaceae. Outros hospedeiros são o Pelargonium spp. e Portulaca oleracea. Algumas espécies de infestantes europeias que podem ser potenciais hospedeiros de populações de R. solanacearum Biovar 2/Raça 3 nas raízes e ou rizosfera, em condições ambientais específicas, incluem Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra e Urtica dioica.

Nota. - O exame visual dos sintomas internos (necrose vascular ou produção de exsudado bacteriano) pode ser feito nesta fase. Pôr de lado qualquer segmento de caule que exiba sintomas e testá-lo separadamente (ver secção II).

2.1.2 - Desinfectar rapidamente os segmentos de caule com etanol a 70% e secar imediatamente com papel absorvente. Em seguida, processar os segmentos de caule de acordo com um dos seguintes procedimentos:

a) Cobrir os segmentos com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice n.º 4) e colocá-los num agitador rotativo (50-100 rpm) durante 4 horas a uma temperatura inferior a 24ºC ou durante 16-24 horas em local refrigerado; ou

b) Processar imediatamente, esmagando os segmentos num saco de maceração resistente (por exemplo, Stomacher ou Bioreba) com um volume adequado de tampão de extracção (apêndice n.º 4), com recurso a um macete de borracha ou um instrumento de trituração adequado (por exemplo, Homex). Se tal não for possível, armazenar os segmentos de caule refrigerados durante, no máximo, 72 horas, ou 24 horas à temperatura ambiente.

2.1.3 - Decantar o sobrenadante após 15 minutos de repouso.

2.1.4 - Não é normalmente necessário proceder à clarificação do extracto ou à concentração da fracção bacteriana, mas estes objectivos podem alcançar-se através de filtração e ou centrifugação, tal como descrito nos n.os 1.1.3 a 1.1.5 da secção III.

2.1.5 - Dividir o extracto puro ou concentrado da amostra em duas partes iguais. Manter uma metade a uma temperatura de 4 a 10ºC durante a realização dos testes e armazenar a outra metade com 10-25% (v/v) de glicerol esterilizado a uma temperatura compreendida entre 16 e 24ºC (semanas) ou 68 e 86ºC (meses), caso seja necessário proceder a mais testes.

2.2 - Ensaio:

Ver fluxograma e descrição dos testes e protocolos optimizados nos respectivos apêndices:

Isolamento selectivo (ver n.º 4 da parte A da secção VI;

Teste IF (ver n.º 5 da parte A da secção VI);

Testes PCR (ver n.º 6 da parte A da secção VI);

Teste FISH (ver n.º 7 da parte A da secção VI);

Testes ELISA (ver n.º 8 da parte A da secção VI);

Bioensaio (ver n.º 9 da parte A da secção VI).

SECÇÃO IV

1 - Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em água:

(ver documento original)

2 - Métodos de detecção e identificação de R. solanacearum em água:

Princípio:

O esquema de detecção validado descrito nesta secção é aplicável à detecção do patogéneo em amostras de águas superficiais, podendo também ser aplicado a amostras de efluentes de transformação de batata ou de esgotos. Contudo, é importante notar que a sensibilidade de detecção esperada irá variar consoante o substrato. A sensibilidade do teste de isolamento é afectada pelas populações de bactérias saprófitas competidoras, normalmente muito superiores nos efluentes de transformação de batata e de esgotos do que nas águas superficiais. Embora se espere que o esquema a seguir descrito detecte, pelo menos, 10(elevado a 3) células por litro nas águas superficiais, a sensibilidade de detecção nos efluentes de transformação de batata e de esgotos deverá ser bastante inferior. Por isso, recomenda-se que se testem os efluentes depois de quaisquer tratamentos de purificação (por exemplo, sedimentação ou filtração), durante os quais os níveis populacionais de bactérias saprófitas diminuem. Devem considerar-se as limitações em termos de sensibilidade do esquema de ensaio, ao avaliar a fiabilidade de eventuais resultados negativos obtidos. Embora este esquema tenha sido usado com êxito em prospecções para determinar a presença ou ausência do patogéneo em águas superficiais, devem reconhecer-se as limitações do seu uso em prospecções semelhantes de efluentes de transformação de batata ou de esgotos.

2.1 - Preparação da amostra:

Nota. - A detecção de R. solanacearum em águas superficiais é mais fiável no final da Primavera, no Verão e no Outono, quando a temperatura da água é superior a 15ºC.

A realização de amostragens repetidas em diferentes momentos do período mencionado anteriormente em pontos de amostragem designados aumentará a fiabilidade da detecção pela redução dos efeitos da variação climática.

Ter em conta os efeitos das fortes precipitações e a geografia do curso de água, para evitar os efeitos de uma diluição exagerada, que poderão camuflar a presença do patogéneo.

Recolher amostras de águas superficiais na proximidade de plantas hospedeiras, caso estas existam.

2.1.1 - Nos pontos de amostragem seleccionados, recolher amostras de água enchendo tubos ou frascos esterilizados e descartáveis, se possível, a uma profundidade superior a 30 cm e a menos de 2 m da margem. Para os efluentes da transformação de batata e de esgotos, recolher amostras no ponto de descarga dos efluentes. Recomenda-se que o volume das amostras não deverá ultrapassar os 500 ml por ponto de amostragem. Caso se prefiram amostras mais pequenas, é aconselhável recolher amostras, pelo menos, três vezes por ponto de amostragem, devendo cada amostra ser constituída por duas subamostras duplicadas de, pelo menos, 30 ml cada. Para prospecções mais intensivas, seleccionar pelo menos três pontos de amostragem por cada 3 km de curso de água e certificar-se de que são também recolhidas amostras dos afluentes que entram no curso de água.

2.1.2 - Transportar as amostras refrigeradas 4-10ºC) e no escuro e testá-las no prazo de 24 horas.

2.1.3 - Caso seja necessário, a fracção bacteriana pode ser concentrada por um dos seguintes métodos:

a) Centrifugar subamostras de 30-50 ml a 10000 g durante 10 minutos (ou a 7000 g durante 15 minutos), de preferência a uma temperatura entre 4 e 10ºC, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de ressuspensão (apêndice n.º 4); ou

b) Filtração com membrana (dimensão mínima do poro de 0,45 (mi)m), seguida de lavagem do filtro com 5-10 ml de tampão de ressuspensão e recuperação das suspensões resultantes da lavagem. Este método é adequado para volumes maiores de água contendo um reduzido número de saprófitas;

Em geral, não se aconselha a concentração para amostras de efluentes de transformação de batata ou de esgotos, dado que a existência de níveis populacionais mais elevados de bactérias saprófitas competidoras inibirá a detecção da R. solanacearum.

2.2 - Ensaio:

Ver fluxograma e descrição dos testes nos respectivos apêndices.

SECÇÃO V

1 - Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum no solo:

(ver documento original)

2 - Métodos de detecção e identificação de R. solanacearum no solo:

Princípios:

O esquema de detecção validado descrito nesta secção é aplicável à detecção do patogéneo em amostras de solo, embora possa também ser usado para análise de amostras de resíduos sólidos de transformação de batata ou de lamas de depuração. Deve notar-se, porém, que estes métodos não são suficientemente sensíveis para garantir a detecção de populações baixas e/ou dispersas de modo irregular de R. Solanacearum que podem ocorrer em amostras naturalmente contaminadas desses substratos.

Devem considerar-se as limitações em termos de sensibilidade deste esquema de ensaio, ao avaliar a fiabilidade dos resultados negativos obtidos e também quando usado em prospecções para determinar a presença ou ausência do patogéneo em solos ou em lamas. O teste mais fiável para detectar a presença do patogéneo num campo consiste em plantar um hospedeiro susceptível e controlá-lo para detectar uma eventual infecção, mas, mesmo com este método, não serão detectados os baixos níveis de contaminação.

2.1 - Preparação da amostra:

2.1.1 - A recolha de amostras de solo de um campo deve seguir os princípios comuns usados para a amostragem de nemátodos. Recolher 0,5-1 kg de solo por amostra de 60 locais por cada 0,3 ha, a uma profundidade de 10-20 cm (ou numa grelha de 7 x 7 metros). Caso se suspeite de presença do patogéneo, aumentar o número de pontos de recolha para 120 por 0,3 ha. Manter as amostras a 12-15ºC antes do seu processamento. Para as amostras de resíduos provenientes da transformação de batata ou de lamas de depuração, recolher um total de 1 kg dos locais representativos do volume total dos resíduos e lamas a testar. Misturar bem cada uma das amostras antes de efectuar os testes.

2.1.2 - Dispersar subamostras de 10-25 g de solos, resíduos sólidos de transformação de batata ou lamas num agitador rotativo (250 rpm) em 60-150 ml de tampão de extracção (apêndice n.º 4) durante um período máximo de duas horas. Se necessário, pode auxiliar-se a dispersão mediante adição de 0,02% de Tween-20 e de 10-20 g de cascalho esterilizados.

2.1.3 - Manter a suspensão a 4ºC durante os testes.

2.2 - Ensaio:

Ver fluxograma e descrição dos testes nos respectivos apêndices.

SECÇÃO VI

Protocolos optimizados para detecção e identificação de R. Solanacearum

PARTE A

Testes de diagnóstico e detecção

1 - Teste de exsudação do caule:

A presença de R. solanacearum em caules de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sintomas de murchidão pode ser avaliada através de um simples teste inicial: cortar o caule imediatamente acima do nível do solo. Suspender a superfície cortada num tubo de ensaio com água límpida. Passados alguns minutos, procurar observar uma exsudação bacteriana espontânea característica a partir dos feixes vasculares.

2 - Detecção de grânulos de poli-â-hidroxibutirato:

1) Preparar um esfregaço do exsudado bacteriano proveniente do tecido infectado ou de uma cultura de 48 horas em meio YPGA ou SPA (apêndice n.º 2) numa lâmina de microscópio;

2) Preparar esfregaços de controlo positivo com uma estirpe de R. solanacearum Biovar 2 e, se necessário, um esfregaço de uma espécie reconhecidamente negativa no teste PHB como controlo negativo;

3) Deixar secar ao ar e, em seguida, passar rapidamente a parte inferior de cada lâmina à chama para fixar os esfregaços;

4) Corar a preparação com azul de Nilo ou negro de Sudão e observar ao microscópio de acordo com o procedimento a seguir descrito:

Teste de azul de Nilo:

a) Cobrir cada lâmina com uma solução aquosa a 1% de azul de Nilo A e incubar durante 10 minutos a uma temperatura de 55ºC;

b) Sacudir as gotas de solução corante. Lavar brevemente e com cuidado em água corrente. Retirar o excesso de água com papel absorvente;

c) Cobrir o esfregaço com uma solução aquosa a 8% de ácido acético e incubar durante um minuto à temperatura ambiente;

d) Lavar brevemente e com cuidado em água corrente. Retirar o excesso de água com papel absorvente;

e) Voltar a humedecer com uma gota de água e cobrir com uma lamela;

f) Examinar o esfregaço corado coberto com uma gota de óleo de imersão em microscópio de epifluorescência a 450 nm, utilizando uma objectiva de imersão em óleo ou água e uma ampliação de 600-1000X;

g) Os grânulos de PHB apresentam uma fluorescência laranja viva. Observar também com luz normal transmitida para verificar se os grânulos são intracelulares e se a morfologia das células é típica de R. solanacearum.

Teste do negro de Sudão:

a) Corar cada lâmina com uma solução a 0,3% de negro de Sudão B em etanol a 70% e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente;

b) Sacudir as gotas de solução corante e lavar brevemente em água corrente, retirando o excesso de água com papel absorvente;

c) Mergulhar as lâminas brevemente em xilol e secar sobre papel absorvente.

Nota. - Cuidado! O xilol é um produto nocivo. Tomar as medidas de segurança necessárias e trabalhar em «hotte».

d) Corar as lâminas com uma solução aquosa a 0,5% (p/v) de safranina e incubar durante 10 segundos à temperatura ambiente;

Nota. - Cuidado! A safranina é um produto nocivo. Tomar as medidas de segurança necessárias e trabalhar em «hotte».

e) Lavar com cuidado em água corrente, secar em papel absorvente e cobrir com uma lamela;

f) Examinar os esfregaços corados cobertos com óleo de imersão em microscópio com luz transmitida e com uma ampliação de 1000X, utilizando uma objectiva de imersão em óleo;

g) Os grânulos de PHB em células de R. solanacearum apresentam uma coloração azul negra e as paredes celulares apresentam uma coloração rosa.

3 - Testes serológicos de aglutinação:

A melhor forma de observar a aglutinação de células de R. solanacearum em exsudado bacteriano ou extractos de tecido sintomático é mediante a utilização de anticorpos marcados validados (ver apêndice n.º 3), utilizando marcadores corados adequados como, por exemplo, células de Staphylococcus aureus ou partículas de látex coradas. Em caso de utilização de material disponível no mercado (ver apêndice n.º 3), seguir as instruções do fabricante. Caso contrário, aplicar o procedimento seguinte:

a) Misturar gotas de uma suspensão de anticorpos marcados e exsudado bacteriano (aproximadamente 5 (mi)l de cada) nos poços de lâminas multiteste;

b) Preparar controlos positivos e negativos utilizando suspensões de R. solanacearum Biovar 2 e de uma estirpe heteróloga,

c) Depois de homogeneizar com cuidado durante 15 segundos, observar a produção de aglutinação nas amostras positivas.

4 - Isolamento selectivo:

4.1 - Diluição em placas com meio selectivo:

Nota. - Antes de utilizar este método pela primeira vez, efectuar testes preliminares para garantir a detecção reprodutível de 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) unidades formadoras de colónias (ufc) de R. solanacearum por ml adicionadas a extractos de amostras que apresentaram anteriormente resultados negativos.

Utilizar um meio selectivo devidamente validado, como o SMSA (alterado por Elphinstone et al., 1996, ver apêndice n.º 2).

É necessário estar atento de forma a diferenciar R. solanacearum de outras bactérias que possam desenvolver colónias no meio. Além disso, as colónias de R. solanacearum podem apresentar morfologia atípica em caso de sobrepopulação das placas ou se estiverem também presentes bactérias antagonistas. Se se suspeitar de efeitos de competição ou antagonismo, a amostra deve ser reanalisada utilizando um teste diferente.

Pode esperar-se a sensibilidade de detecção mais elevada com este método quando se utilizam extractos de amostras recentemente preparados. No entanto, o método pode também ser aplicado a extractos que tenham sido armazenados em glicerol a uma temperatura compreendida entre 68 e 86ºC.

Como controlos positivos, preparar diluições decimais de uma suspensão de 10(elevado a 6) ufc por ml de uma estirpe virulenta de R. solanacearum Biovar 2 (por exemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Para evitar qualquer possibilidade de contaminação, os controlos positivos devem ser sempre preparados à parte das amostras a testar.

A boa qualidade de cada novo lote de meio selectivo para o crescimento do patogéneo deve ser testada antes da sua utilização para a análise de amostras de rotina.

Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

4.1.1 - Aplicar uma técnica de diluição em placas adequada, a fim de garantir a diluição de eventuais populações saprófitas formadoras de colónias. Espalhar, por placa, 50-100 (mi)l de extracto de amostra por cada diluição.

4.1.2 - Incubar as placas a 28ºC. Observar as placas após 48 horas e em seguida diariamente durante um período de até 6 dias. As colónias típicas de R. solanacearum em SMSA apresentam, de início, uma cor branca leitosa, são achatadas, irregulares e fluida se após 3 dias de incubação o centro adquire uma coloração rosa a vermelho-vivo com estrias ou espirais internas (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Nota. - Neste meio formam-se por vezes colónias atípicas de R. solanacearum, que podem ser pequenas, redondas, completamente vermelhas e não fluidas ou apenas parcialmente fluidas e, portanto, difíceis de distinguir de bactérias saprófitas formadoras de colónias.

4.1.3 - Purificar as presumíveis colónias de R. solanacearum por reticulado ou diluição em placas num meio nutritivo geral a fim de obter colónias isoladas (ver apêndice n.º 2).

4.1.4 - Armazenar as culturas a curto prazo em água desionizada esterilizada (pH 6-8) à temperatura ambiente, no escuro, ou a longo prazo num meio crioprotector adequado entre 68 e 86ºC ou liofilizadas.

4.1.5 - Identificar culturas de presumíveis isolados de R. solanacearum (ver parte B da secção VI) e efectuar um teste de patogenicidade (ver parte C da secção VI).

Interpretação dos resultados da diluição em placas com meio selectivo:

O teste de diluição em placas com meio selectivo é negativo se não for observada nenhuma colónia bacteriana ao fim de seis dias ou se não forem encontradas colónias presumivelmente características de R. solanacearum, desde que não se suspeite de inibição resultante de concorrência ou antagonismo de outras bactérias e que sejam detectadas colónias características de R. solanacearum nos controlos positivos.

O teste de diluição em placas com meio selectivo é positivo se forem isoladas colónias de presumíveis isolados de R. solanacearum.

4.2 - Operação de enriquecimento:

Utilizar um meio de enriquecimento validado, como o caldo Wilbrink modificado (ver apêndice n.º 2).

Este procedimento pode ser utilizado para aumentar selectivamente as populações de R. solanacearum nos extractos de amostras e aumentar a sensibilidade de detecção. Este procedimento também dilui de forma eficaz os inibidores da reacção da PCR (1:100). Importa referir, no entanto, que o enriquecimento de R. solanacearum pode ser infrutífero devido à competição ou ao antagonismo de organismos saprófitas, que em muitos casos são enriquecidos simultaneamente. Por esta razão, o isolamento de R. solanacearum a partir de meios líquidos de cultura enriquecidos pode ser difícil. Além disso, como as populações de saprófitas serologicamente afins podem aumentar, recomenda-se a utilização de anticorpos monoclonais específicos em vez de anticorpos policlonais quando se utilize o teste ELISA.

4.2.1 - Para o teste PCR com enriquecimento, transferir 100 (mi)l de extracto de amostra para 10 ml de meio líquido de enriquecimento (apêndice n.º 2) previamente separado em alíquotas para tubos ou frascos isentos de ADN. Para o teste ELISA com enriquecimento podem utilizar-se diluições mais concentradas do extracto da amostra (por exemplo 100 (mi)l em 1,0 ml de caldo de enriquecimento).

4.2.2 - Incubar durante 72 horas a uma temperatura compreendida entre os 27 e 30ºC em cultura agitada ou estática, mantendo as tampas dos recipientes apertadas frouxamente para permitir o arejamento.

4.2.3 - Misturar bem antes de utilizar nos testes ELISA ou PCR.

4.2.4 - Tratar o meio líquido enriquecido de modo idêntico ao da(s) amostra(s) nos testes acima referidos.

Nota. - Se for de prever a inibição do enriquecimento de R. solanacearum devido à existência de grandes populações de certas bactérias saprófitas competidoras, poderão conseguir-se melhores resultados como enriquecimento dos extractos de amostras antes de se efectuar uma centrifugação ou outros processos de concentração.

5 - Teste IF:

Princípio:

A utilização do teste IF como teste de rastreio essencial é recomendada, tendo em conta a sua robustez comprovada para alcançar os limiares de detecção exigidos.

Sempre que se utilize o teste IF como teste de rastreio essencial e o seu resultado seja positivo, terá de se realizar o teste de isolamento, o teste PCR ou o teste FISH como segundo teste de rastreio. Sempre que se utilize o teste IF como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, terão de se realizar mais testes de acordo com o fluxograma para completar a análise.

Nota. - Utilizar anticorpos validados para R. solanacearum (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Recomenda-se a determinação do título para cada novo lote de anticorpos. O título é definido como a diluição mais elevada para a qual se verifica uma reacção óptima ao testar uma suspensão contendo 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células por ml de uma estirpe homóloga de R. solanacearum e recorrendo a um conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC), de acordo com as recomendações do fabricante. Todos os anti-soros policlonais validados têm um título de IF de 1:2000 no mínimo. Durante o teste os anticorpos devem ser utilizados em diluições de trabalho próximas do título ou no seu valor exacto.

O teste deve ser realizado com extractos de amostras recentemente preparados. Se necessário, pode ser executado com sucesso com extractos armazenados entre 68 e 86ºC e conservados em glicerol. O glicerol pode ser retirado da amostra através da adição de 1 ml de tampão de ressuspensão (apêndice n.º 4), nova centrifugação durante 15 minutos a 7000 g e ressuspensão num volume igual de tampão de ressuspensão. Este procedimento é frequentemente desnecessário, em especial se as lâminas forem fixadas à chama.

Preparar lâminas de controlo positivo em separado com uma estirpe homóloga, ou qualquer outra estirpe de referência de R. solanacearum, suspensa em extracto de batata, tal como especificado na parte B do apêndice n.º 3 ou opcionalmente em tampão.

Sempre que possível, deve também ser utilizado material vegetal naturalmente infectado (liofilizado ou congelado a uma temperatura compreendida entre 16 e 24ºC) como controlo positivo na mesma lâmina.

Como controlos negativos, podem ser utilizadas alíquotas de extracto de amostra que se tenham anteriormente revelado negativas relativamente à presença de R. solanacearum.

Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados neste teste são referidos no apêndice n.º 3.

Utilizar lâminas de microscópio com vários poços, de preferência 10, com, pelo menos, 6 mm de diâmetro cada.

Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

5.1 - Preparar as lâminas através de um dos seguintes procedimentos:

i) Para sedimentos com relativamente pouco amido:

Pipetar um volume-padrão (15 (mi)l é adequado para poços com 6 mm de diâmetro - aumentar o volume proporcionalmente à dimensão dos poços) de uma diluição de 1/100 do sedimento de batata ressuspenso no primeiro poço. Em seguida, pipetar um volume similar de sedimento não diluído (1/1) nos restantes poços da fila. A segunda fila de poços pode ser utilizada como um duplicado ou para outra amostra, como indicado na figura n.º 1;

ii) Para outros sedimentos:

Preparar diluições decimais (1/10, 1/100) do sedimento ressuspenso em tampão de ressuspensão. Pipetar um volume-padrão (15 (mi)l é adequado para poços com 6 mm de diâmetro - aumentar o volume proporcionalmente à dimensão dos poços) do sedimento ressuspenso e de cada uma das diluições numa fila de poços. A segunda fila de poços pode ser utilizada como um duplicado ou para outra amostra, como indicado na figura n.º 2.

5.2 - Secar as gotículas à temperatura ambiente ou por aquecimento a uma temperatura compreendida entre 40 e 45ºC. Fixar as células bacterianas na lâmina por aquecimento (15 minutos a 60ºC), à chama, com etanol a 95%, ou em conformidade com instruções específicas dos fornecedores dos anticorpos.

Se necessário, as lâminas assim tratadas podem ser armazenadas congeladas numa caixa de dessecação durante o menor tempo possível (até um máximo de 3 meses) antes de serem testadas.

5.3 - Procedimento IF:

i) De acordo com a preparação da lâmina descrita na alínea i) do n.º 5.1:

Preparar um conjunto de diluições a 1/2 do anti-soro em tampão IF. O primeiro poço deverá ter 1/2 do título (T/2), os restantes 1/4 do título (T/4), 1/2 do título (T/2), o título (T) e o dobro do título (2T);

ii) De acordo com a preparação da lâmina descrita na alínea ii) do n.º 5.1:

Preparar a diluição de trabalho (DT) do anticorpo em tampão IF. A diluição de trabalho afecta a especificidade.

FIGURA N.º 1

Preparação da lâmina de acordo com a alínea i) do n.º 5.1 e a alínea i) do n.º 5.3

(ver documento original)

FIGURA N.º 2

Preparação da lâmina de acordo com a alínea ii) do n.º 5.1 e a alínea ii) do n.º 5.3

(ver documento original)

5.3.1 - Dispor as lâminas sobre papel absorvente humedecido. Cobrir por completo cada poço a testar com a(s) diluição(ões) de anticorpo. O volume de anticorpo adicionado a cada poço deve ser, pelo menos, igual ao volume de extracto aplicado.

O procedimento seguinte deverá ser efectuado na ausência de instruções específicas dos fornecedores dos anticorpos:

5.3.2 - Incubar as lâminas sobre papel humedecido durante 30 minutos à temperatura ambiente (18 a 25ºC) numa caixa opaca fechada.

5.3.3 - Sacudir as gotículas de cada lâmina e lavar cuidadosamente com tampão IF. Lavar por submersão durante 5 minutos em tampão IF-Tween (apêndice n.º 4) e subsequentemente em tampão IF. Evitar a transferência de aerossóis ou de gotículas, o que poderia dar origem a uma contaminação cruzada. Eliminar cuidadosamente a humidade em excesso, secando suavemente com papel absorvente.

5.3.4 - Dispor as lâminas sobre papel humedecido. Cobrir os poços a testar com a diluição do conjugado FITC utilizada para determinar o título. O volume de conjugado adicionado aos poços deve ser idêntico ao volume de anticorpo utilizado.

5.3.5 - Incubar as lâminas sobre papel humedecido durante 30 minutos à temperatura ambiente (18 a 25ºC) numa caixa opaca fechada.

5.3.6 - Sacudir da lâmina as gotículas de conjugado. Lavar como anteriormente (n.º 5.3.3).

Retirar cuidadosamente o excesso de humidade.

5.3.7 - Pipetar para cada poço 5-10 (mi)l de uma solução de tampão fosfato 0,1 M com glicerol (apêndice n.º 4), ou de um líquido de montagem disponível no mercado que evite a perda rápida de fluorescência, e cobrir com uma lamela.

5.4 - Leitura do teste IF:

5.4.1 - Examinar as lâminas do teste num microscópio de epifluorescência, com filtros adequados para excitação do FITC, utilizando uma lente de imersão em óleo ou água, com uma ampliação de 500-1000X. Examinar os poços ao longo de dois diâmetros perpendiculares e à volta do perímetro. Para amostras que não revelem células, ou cujo número seja reduzido, observar, pelo menos, 40 campos do microscópio.

Observar primeiro a lâmina do controlo positivo. As células devem apresentar-se com uma fluorescência brilhante e completamente coradas no título do anticorpo ou diluição de trabalho determinados. O teste IF (n.º 5 da parte A da secção VI) deve ser repetido se a coloração for aberrante.

5.4.2 - Procurar células fluorescentes brilhantes com a morfologia característica de R. Solanacearum nos poços em estudo das lâminas a testar (ver http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). A intensidade de fluorescência deve ser equivalente à da estirpe do controlo positivo, para a mesma diluição do anticorpo. As células com coloração incompleta ou com fluorescência fraca não devem ser consideradas.

Caso se suspeite de qualquer contaminação, o teste deve ser repetido. Este pode ser o caso quando todas as lâminas de um lote revelem células positivas devido à contaminação do tampão ou se forem encontradas células positivas (fora dos poços da lâmina) no revestimento da lâmina.

5.4.3 - Há vários problemas inerentes à especificidade do teste de imunofluorescência. Em sedimentos de cones de hilo e de segmentos de caule da batateira, é possível a ocorrência de populações de células fluorescentes com morfologia atípica e reacções cruzadas de bactérias saprófitas com dimensões e morfologia semelhantes a R. solanacearum.

5.4.4 - Considerar apenas células fluorescentes com dimensões e morfologia típicas no título ou na diluição de trabalho dos anticorpos, tal como descrito em 5.3.

5.4.5 - Interpretação da leitura do teste IF:

i) Se forem detectadas células fluorescentes brilhantes e com a morfologia característica, determinar o número médio de células típicas por cada campo do microscópio e calcular o número de células típicas por ml de sedimento ressuspenso (apêndice n.º 5);

Nota. - A leitura do teste IF revela um resultado positivo para amostras com, pelo menos, 5 x 10(elevado a 3) células típicas por ml de sedimento ressuspenso. A amostra é considerada como potencialmente contaminada, sendo necessário efectuar outros testes.

ii) A leitura do teste IF revela um resultado negativo para amostras com menos de 5 x 10(elevado a 3) células por ml de sedimento ressuspenso sendo a amostra considerada negativa. A realização de outros testes não é obrigatória.

6 - Testes PCR:

Princípios:

Sempre que se utilize PCR como teste de rastreio principal e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar o teste de isolamento ou o teste IF como segundo teste obrigatório de rastreio. Sempre que se utilize o teste PCR como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, terão de se realizar mais testes de acordo com o fluxograma para completar o diagnóstico.

A exploração completa deste método como teste de rastreio principal é apenas recomendada quando tenham sido adquiridos conhecimentos altamente especializados.

Nota. - Os resultados preliminares obtidos com este teste deveriam permitir a detecção reprodutível de 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células de R. solanacearum por ml adicionadas a extractos de amostras que apresentaram anteriormente resultados negativos. Podem ser necessárias experiências de optimização para alcançar os níveis máximos de sensibilidade e especificidade em todos os laboratórios.

Utilizar os reagentes e protocolos PCR validados (ver apêndice n.º 6). Seleccionar, de preferência, um método que disponha de um controlo interno.

Tomar as precauções necessárias para evitar a contaminação da amostra com ADN-alvo. O teste PCR deve ser realizado por técnicos experimentados, em laboratórios de biologia molecular especializados, no sentido de minimizar a possibilidade de contaminação com ADN-alvo.

Os controlos negativos (para os procedimentos de extracção de ADN e PCR) devem ser sempre manipulados como amostras finais no procedimento, a fim de evidenciar a ocorrência de qualquer contaminação com ADN.

Devem ser incluídos no teste PCR os seguintes controlos negativos:

Extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado e se tenha revelado negativo relativamente à presença de R. solanacearum;

Controlos dos tampões utilizados para extrair a bactéria e o ADN da amostra;

Mistura de reacção de PCR.

Devem ser incluídos os seguintes controlos positivos:

Alíquotas de sedimentos ressuspensos às quais se adicionou R. solanacearum (ver preparação na parte B do apêndice n.º 3);

Uma suspensão em água contendo 10(elevado a 6) células por ml de um isolado virulento de R. solanacearum (por exemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ver parte B do apêndice n.º 3);

Se possível, utilizar também ADN extraído de amostras positivas ao realizar o teste PCR.

Nota. - Para evitar uma potencial contaminação, os controlos positivos deverão ser preparados num ambiente separado do das amostras a serem testadas.

Os extractos de amostras devem estar, o mais possível, isentos de terra. É, por isso, prudente, em certos casos, preparar os extractos a partir de material vegetal, caso se utilizem os testes PCR.

Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados para este teste estão mencionados no apêndice n.º 3.

6.1 - Métodos de purificação do ADN:

Utilizar amostras de controlo positivo e negativo, tal como acima descrito (ver apêndice n.º 3).

Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

Existe uma variedade de métodos para a purificação de ADN-alvo a partir de amostras de substratos complexos, removendo, deste modo, os inibidores de PCR e outras reacções enzimáticas e concentrando o ADN-alvo no extracto de amostra. O método seguinte foi optimizado para utilização com os métodos PCR validados referidos no apêndice n.º 6:

a) Método de acordo com Pastrik (2000):

1) Pipetar 220 (mi)l de tampão de lise (NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM [pH 8,0], EDTA 1 mM [pH 8,0]) para um tubo Eppendorf de 1,5 ml;

2) Adicionar 100 (mi)l de extracto de amostra e colocar num bloco de aquecimento ou em banho-maria a 95ºC durante 10 minutos;

3) Colocar o tubo em gelo durante 5 minutos;

4) Adicionar 80 (mi)l de solução concentrada de lisozima (50 mg de lisozima por ml em Tris HCl 10 mM, pH 8,0) e incubar a 37ºC durante 30 minutos;

5) Adicionar 220 (mi)l de solução A Easy DNA(R) (Invitrogen), misturar bem em vortex e incubar a 65ºC durante 30 minutos;

6) Adicionar 100 (mi)l de solução B Easy DNA(R) (Invitrogen), agitar vigorosamente em vortex até que o precipitado se desloque livremente no tubo e a amostra esteja uniformemente viscosa;

7) Adicionar 500 (mi)l de clorofórmio e agitar em vortex até que a viscosidade diminua e a mistura se torne homogénea;

89 Centrifugar a 15000 g durante 20 minutos a 4ºC para separar as fases e formar a interfase;

9) Transferir a fase superior para um novo tubo Eppendorf;

10) Adicionar 1 ml de etanol a 100% (-20ºC), agitar brevemente em vortex e incubar no gelo durante 10 minutos;

11) Centrifugar a 15000 g durante 20 minutos a 4ºC e remover o etanol do sedimento;

12) Adicionar 500 (mi)l de etanol a 80% (-20ºC) e misturar invertendo o tubo;

13) Centrifugar a 15000 g durante 10 minutos a 4ºC, guardar o sedimento e remover o etanol;

14) Deixar secar o sedimento ao ar ou em «DNA speed vac»;

15) Ressuspender o sedimento em 100 (mi)l de água ultra pura (UPW) esterilizada e deixar à temperatura ambiente durante, pelo menos, 20 minutos;

16) Armazenar a 20ºC até ser necessário para a realização de PCR;

17) Centrifugar qualquer precipitado branco até que este se deposite no fundo e utilizar 5 (mi)l do sobrenadante contendo ADN para PCR.

b) Outros métodos:

Podem ser aplicados outros métodos de extracção de ADN, por exemplo o Qiagen DNeasy Plant Kit, desde que esteja provado que são igualmente eficazes na purificação do ADN a partir de amostras de controlo contendo 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células do patogéneo por ml.

6.2 - PCR:

6.2.1 - Preparar as amostras a testar e controlos para PCR em conformidade com os protocolos validados (n.º 6 da parte A da secção VI). Preparar uma diluição decimal de extracto de ADN da amostra (1:10 em UPW).

6.2.2 - Preparar a mistura adequada de reacção PCR num ambiente isento de contaminação, de acordo com os protocolos publicados (apêndice n.º 6). Quando possível, recomenda-se a utilização de um protocolo PCR multiplex que incorpore também um controlo interno de PCR.

6.2.3 - Adicionar 2-5 (mi)l de extracto de ADN à mistura de reacção de PCR de forma a obter um volume final de 25 (mi)l em tubos PCR esterilizados de acordo com os protocolos PCR (ver apêndice n.º 6).

6.2.4 - Incorporar uma amostra de controlo negativa contendo apenas mistura de reacção PCR e adicionar a mesma fonte de UPW utilizada na mistura PCR em vez da amostra.

6.2.5 - Colocar os tubos no mesmo termociclador que foi utilizado nos testes preliminares e iniciar o programa devidamente optimizado de PCR (apêndice n.º 6).

6.3 - Análise do produto PCR

6.3.1 - Proceder à electroforese em gel de agarose dos fragmentos amplificados por PCR. Correr, pelo menos, 12 (mi)l de mistura de reacção contendo o ADN amplificado de cada uma das amostras, misturados com 3 (mi)l de tampão de carregamento (apêndice n.º 6) em géis de agarose a 2,0% (p/v) em tampão de tris acetato-EDTA (TAE) (apêndice n.º 6) a 5-8 V por cm. Utilizar um marcador de ADN adequado, por exemplo, «100 bp ladder».

6.3.2 - Revelar as bandas de ADN através de coloração em brometo de etídio (0,5 mg por l) durante 30-60 minutos, tomando as precauções adequadas para manusear este agente mutagénico.

6.3.3 - Observar o gel corado num transiluminador com UV de ondas curtas ((lambda) = 302 nm) para detecção de produtos amplificados de PCR de tamanho esperado (apêndice n.º 6) e documentar.

6.3.4 - Para todas as novas detecções/situações, verificar a autenticidade do fragmento amplificado por PCR através da realização de análise de restrição enzimática numa amostra do ADN amplificado restante, por incubação com uma enzima de restrição e um tampão adequados à temperatura e com duração óptimas (ver apêndice n.º 6). Proceder, tal como anteriormente, à electroforese em gel de agarose dos fragmentos digeridos e observar o padrão característico dos fragmentos de restrição num transiluminador com UV, após coloração com brometo de etídio, e comparar com o controlo positivo não digerido e digerido.

Interpretação do resultado do teste PCR:

O teste PCR é considerado negativo caso o fragmento amplificado por PCR de tamanho específico esperado para R. solanacearum não seja detectado para a amostra em estudo, mas seja detectado em todas as amostras de controlo positivo (no caso de PCR multiplex com iniciadores de controlo interno específicos para as plantas, deverá ser detectado um segundo produto PCR de tamanho esperado na amostra em estudo).

O teste PCR é considerado positivo caso seja detectado o fragmento amplificado por PCR específico para R. solanacearum de tamanho e padrão de restrição esperados (quando exigido), desde que não seja amplificado a partir de nenhuma das amostras de controlo negativo. A confirmação fiável de um resultado positivo pode também ser obtida mediante a repetição do teste com um segundo conjunto de iniciadores de PCR (apêndice n.º 6).

Nota. - Pode suspeitar-se de inibição de PCR se o fragmento amplificado esperado for observado na amostra de controlo positivo de uma suspensão aquosa de R. solanacearum, mas se obtenham resultados negativos de controlos positivos de R. Solanacearum em extracto de batata. Nos protocolos PCR multiplex com controlos internos de PCR, a inibição da reacção é indicada sempre que não se obtenha nenhum dos dois fragmentos amplificados esperados.

Pode suspeitar-se de contaminação caso o fragmento amplificado esperado seja obtido em um ou vários dos controlos negativos.

7 - Teste FISH:

Princípio:

Sempre que se utilize o teste FISH como primeiro teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar o teste de isolamento ou o teste IF como segundo teste obrigatório de rastreio. Sempre que se utilize o teste FISH como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar mais testes de acordo com o fluxograma para completar o diagnóstico.

Nota. - Utilizar sondas validadas específicas para R. solanacearum (apêndice n.º 7). O teste preliminar com este método deveria permitir a detecção reprodutível de, pelo menos, 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células de R. solanacearum por ml adicionadas a extractos de amostras que se revelaram negativos.

O procedimento seguinte deve ser realizado, de preferência, com um extracto de amostra preparado na altura da utilização, mas pode também ser realizado com sucesso com um extracto de amostra que tenha sido armazenado em glicerol a uma temperatura compreendida entre -16 e 24ºC ou 68 e 86ºC.

Como controlos negativos, utilizar alíquotas de extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado com resultado negativo para R. solanacearum.

Como controlos positivos preparar suspensões contendo 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células de R. solanacearum Biovar 2 por ml (por exemplo, estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ver apêndice n.º 3) em tampão fosfato (PB) 0,01 M, a partir de uma cultura com 3 a 5 dias. Preparar lâminas de controlo positivo em separado com a estirpe homóloga, ou qualquer outra estirpe de referência de R. solanacearum, suspensa em extracto de batata, tal como especificado na parte B do apêndice n.º 3.

A utilização de sondas para eubacterias marcadas com FITC oferece um controlo para o processo de hibridação, visto que todas as eubactérias presentes na amostra ficarão coradas.

Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados para este teste são enumerados na parte A do apêndice n.º 3.

Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

7.1 - Fixação do extracto de batata:

O protocolo seguinte tem por base Wullings et al.(1998):

7.1.1 - Preparar a solução fixadora (ver apêndice n.º 7).

7.1.2 - Pipetar 100 (mi)l de cada extracto de amostra para um tubo Eppendorf e centrifugar durante 7 minutos a 7000 g.

7.1.3 - Remover o sobrenadante e dissolver o sedimento em 200 (mi)l de fixador preparado há menos de 24 horas. Agitar em vortex e incubar durante 1 hora no frigorífico.

7.1.4 - Centrifugar durante 7 minutos a 7000 g, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 75 (mi)l de PB 0,01M (ver apêndice n.º 7).

7.1.5 - Colocar 16 (mi)l das suspensões fixadas numa lâmina multiteste limpa, tal como demonstrado na figura n.º 3. Aplicar duas amostras não diluídas diferentes por lâmina e utilizar 10 (mi)l para obter uma diluição de 1:100 (em PB 0,01 M). A solução de amostra restante (49 (mi)l) pode ser armazenada a 20ºC após adição de 1 volume de etanol a 96%. Caso o teste FISH exija uma repetição, remover o etanol por centrifugação e adicionar igual volume de PB 0,01 M (agitar em vortex).

FIGURA N.º 3

Configuração para a lâmina FISH

(ver documento original)

7.1.6 - Secar as lâminas ao ar (ou num secador de lâminas a 37ºC) e proceder à sua fixação à chama.

Nesta fase o procedimento pode ser interrompido e a hibridação continuada no dia seguinte. As lâminas devem ser armazenadas em local sem poeiras e seco, à temperatura ambiente.

7.2 - Hibridação:

7.2.1 - Desidratar as células num gradiente de concentrações de etanol de 50%, 80% e 96% durante 1 minuto cada. Secar as lâminas ao ar num porta-lâminas.

7.2.2 - Preparar uma câmara de incubação húmida, cobrindo o fundo de uma caixa hermética com papel absorvente ou de filtro embebido em 1x «hyb-mix» (apêndice n.º 7). Pré-incubar a caixa na estufa de hibridação a 45ºC durante, pelo menos, 10 minutos.

7.2.3 - Juntar 10 (mi)l de solução de hibridação (apêndice n.º 7) a 8 poços (poços 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 e 10; ver figura n.º 3) de cada lâmina, deixando vazios os dois poços centrais (3 e 8).

7.2.4 - Cobrir os primeiros e os últimos 4 poços com lamelas (24 x 24 mm) sem retenção de ar. Colocar as lâminas na câmara húmida pré-aquecida e hibridar durante 5 horas na estufa a 45ºC, no escuro.

7.2.5 - Preparar 3 copos contendo 1 l de água Milli Q (grau molecular), 1 l de 1x «hybmix» (334 ml 3x «hybmix» e 666 ml água Milli Q) e 1 l de 1/8x de «hybmix» (42 ml 3x «hybmix» e 958 ml água Milli Q). Pré-incubar cada um deles em banho-maria a 45ºC.

7.2.6 - Retirar as lamelas das lâminas e colocar estas últimas no porta-lâminas.

7.2.7 - Remover as sondas em excesso por incubação durante 15 minutos no recipiente com 1x «hybmix» a 45ºC.

7.2.8 - Transferir o porta-lâminas para uma solução de lavagem com 1/8 de «hybmix» e incubar durante mais 15 minutos.

7.2.9 - Mergulhar as lâminas brevemente em água Milli Q e colocá-las sobre papel de filtro. Remover o excesso de humidade cobrindo a superfície suavemente com papel de filtro. Pipetar 5-10 (mi)l de solução de montagem que evite uma rápida perda de fluorescência (por exemplo, Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA ou equivalente) para cada poço e aplicar uma lamela grande (24 x 60 mm) cobrindo toda a lâmina.

7.3 - Leitura do teste FISH

7.3.1 - Observar imediatamente as lâminas com um microscópio equipado para microscopia de epifluorescência, sob lente de imersão em óleo, a uma ampliação de 630 ou 1000 x. Com um filtro indicado para isotiocianato de fluoresceína (FITC), as células eubacterianas (incluindo a maior parte das células gram-negativas) presentes na amostra mostram uma coloração verde fluorescente. Com um filtro para isotiocianato-5-tetrametilrodamina, as células de R. Solanacearum coradas com Cy3 revelam-se vermelho fluorescente. Comparar a morfologia das células com a dos controlos positivos. As células devem apresentar-se com uma fluorescência brilhante e completamente coradas. O teste FISH (n.º 7 da parte A da secção VI) deve ser repetido se a coloração for aberrante. Examinar os poços ao longo de dois diâmetros perpendiculares e à volta do perímetro. Para amostras que não revelem células, ou cujo número seja reduzido, observar, pelo menos, 40 campos do microscópio.

7.3.2 - Procurar células fluorescentes brilhantes com a morfologia característica de R. Solanacearum nos poços das lâminas de teste (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). A intensidade de fluorescência deve ser equivalente ou superior à da estirpe do controlo positivo. As células com coloração incompleta ou com fluorescência fraca não devem ser consideradas.

7.3.3 - Caso se suspeite de qualquer contaminação, o teste deve ser repetido. Este pode ser o caso quando todas as lâminas de um lote revelem células positivas devido à contaminação do tampão ou se forem encontradas células positivas (fora dos poços da lâmina) no revestimento da lâmina.

7.3.4 - Há vários problemas inerentes à especificidade do teste FISH. Em sedimentos de cones de hilo e de segmentos de caule da batateira, é provável a ocorrência de populações de células fluorescentes com morfologia atípica e reacções cruzadas de bactérias saprófitas com dimensões e morfologia semelhantes às de R. solanacearum, apesar de este fenómeno ser menos frequente do que no teste IF.

7.3.5 - Considerar unicamente as células fluorescentes de dimensões e morfologia típicas.

7.3.6 - Interpretação do resultado do teste FISH:

i) Obtêm-se resultados válidos para o teste FISH quando se observarem, com um filtro para FITC, células brilhantes com fluorescência verde de dimensões e morfologia típicas de R. solanacearum e, com o filtro para rodamina, células brilhantes com fluorescência vermelha em todos os controlos positivos, as quais deverão estar ausentes em todos os controlos negativos. Se forem detectadas células fluorescentes brilhantes e com a morfologia característica, determinar o número médio de células típicas por cada campo do microscópio e calcular o número de células típicas por ml de sedimento ressuspenso (apêndice n.º 4). As amostras com, pelo menos, 5 x 10(elevado a 3) células típicas por ml de sedimento ressuspenso são consideradas como potencialmente contaminadas. A realização de outros testes é obrigatória. As amostras com menos de 5 x 10(elevado a 3) células típicas por ml de sedimento ressuspenso são consideradas negativas;

ii) O teste FISH é negativo se, com um filtro para rodamina, não se observarem células brilhantes com fluorescência vermelha e dimensões e morfologia típicas de R. solanacearum, e sejam observadas células típicas brilhantes com fluorescência vermelha nas preparações de controlo positivo.

8 - Testes ELISA:

Princípio:

O teste ELISA só pode ser utilizado como teste opcional em complemento de testes IF, PCR ou FISH, devido à sensibilidade relativamente baixa deste teste. Quando se utiliza o teste DAS ELISA, é obrigatório efectuar o enriquecimento e utilizar anticorpos monoclonais (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Pode ser útil efectuar um enriquecimento das amostras antes de utilizar o teste ELISA a fim de aumentar a sensibilidade deste teste, mas esse enriquecimento pode ser infrutífero devido à concorrência de outros organismos presentes na amostra.

Nota. - Utilizar anticorpos validados para R. solanacearum (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Recomenda-se a determinação do título para cada novo lote de anticorpos. O título é definido como a diluição mais elevada para a qual se verifica uma reacção óptima ao testar uma suspensão contendo 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células por ml de uma estirpe homóloga de R. solanacearum e recorrendo a conjugados de anticorpos secundários adequados, de acordo com as recomendações do fabricante. Durante os testes, os anticorpos devem ser utilizados em diluições de trabalho próximas ou no título da formulação comercial.

Determinar o título dos anticorpos com uma suspensão de 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células por ml de uma estirpe homóloga de R. solanacearum.

Incluir como controlo negativo um extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado com resultado negativo para R. solanacearum e uma suspensão de uma bactéria que não origine reacção cruzada em tampão fosfato salino (PBS).

Como controlo positivo, utilizar alíquotas de extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado com resultado negativo, inoculadas com 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células por ml de R. solanacearum Biovar 2 (por exemplo estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ver partes A e B do apêndice n.º 2). Para a comparação dos resultados de cada placa, utilizar uma suspensão padrão de 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células de R. solanacearum por ml em PBS. Assegurar-se de que os controlos positivos estão bem separados da(s) amostra(s) em estudo na microplaca.

Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados neste teste são descritos na parte A do apêndice n.º 3.

Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

Foram validados dois protocolos ELISA.

a) Teste ELISA indirecto (Robinson Smith et al.,1995):

1) Utilizar alíquotas de 100-200 (mi)l de extracto de amostra. (O aquecimento a 100ºC durante 4 minutos em banho-maria ou num bloco de aquecimento pode, nalguns casos, reduzir os resultados não específicos);

2) Adicionar um volume igual de tampão de revestimento 2 x (apêndice n.º 4) e agitar em vortex;

3) Colocar alíquotas de 100 (mi)l em, pelo menos, dois dos poços de uma microplaca (por exemplo NuncPolysorp ou equivalente) e incubar durante 1 hora a 37ºC ou durante a noite a uma temperatura de 4ºC;

4) Retirar os extractos dos poços. Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice n.º 4), deixando a última solução de lavagem dentro dos poços durante, pelo menos, 5 minutos,

5) Preparar uma diluição adequada de anticorpos contra R. solanacearum em tampão de bloqueio (apêndice n.º 4). Para anticorpos comerciais validados, utilizar as diluições recomendadas (geralmente uma concentração duas vezes superior ao título);

6) Adicionar 100 (mi)l a cada poço e incubar durante 1 hora a 37ºC;

7) Retirar a solução de anticorpos dos poços e lavar como anteriormente (n.º 4);

8) Preparar uma diluição adequada de conjugado anticorpo secundário - fosfatase alcalina em tampão de bloqueio. Adicionar 100 (mi)l a cada poço e incubar durante 1 hora a 37ºC;

9) Retirar o anticorpo conjugado dos poços e lavar como anteriormente (n.º 4);

10) Adicionar 100 (mi)l de solução de substrato de fosfatase alcalina (apêndice n.º 4) a cada poço. Incubar no escuro à temperatura ambiente e ler a absorvância a 405 nm a intervalos regulares durante 90 minutos.

b) DASI ELISA:

1) Preparar uma diluição adequada de imunoglobulinas policlonais anti-R. solanacearum em tampão de revestimento, pH 9,6 (apêndice n.º 4). Adicionar 200 (mi)l a cada poço. Incubar a 37ºC durante 4-5 horas ou a 4ºC durante 16 horas;

2) Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice n.º 4);

Nota. - Adicionar 190 (mi)l de extracto de amostra em, pelo menos, dois poços. Adicionar também controlos positivos e negativos em dois poços de cada placa. Incubar durante 16 horas a 4ºC.

3) Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice n.º 4);

4) Preparar uma diluição adequada de anticorpos monoclonais específicos contra R. solanacearum em PBS (apêndice n.º 4) que contenha também 0,5% de albumina de soro de bovino (BSA) e adicionar 190 (mi)l a cada poço. Incubar a 37ºC durante 2 horas;

5) Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice n.º 4);

6) Preparar uma diluição adequada de imunoglobulinas anti-rato conjugadas com fosfatase alcalina em PBS. Adicionar 190 (mi)l a cada poço. Incubar a 37ºC durante 2 horas;

7) Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice n.º 4);

8) Preparar uma solução de substrato de fosfatase alcalina que contenha 1 mg de fosfato de p-nitrofenilo por ml de tampão de substrato (apêndice n.º 4). Adicionar 200 (mi)l a cada poço. Incubar no escuro à temperatura ambiente e ler a absorvância a 405 nm a intervalos regulares durante 90 minutos.

Interpretação do resultado do teste ELISA:

O teste ELISA é negativo se a média das leituras da densidade óptica (DO) dos poços de amostras duplicadas for (menor que)2 x DO do poço de controlo negativo do extracto de amostra, desde que as DO dos controlos positivos sejam todas superiores a 1,0 (após 90 minutos de incubação com o substrato) e sejam superiores ao dobro da DO obtida para os extractos de amostras negativas.

O teste ELISA é positivo se a DO média dos poços de amostras duplicadas for (maior que) 2 x DO do poço de extracto de amostra negativa, desde que as DO de todos os poços de controlo negativo sejam (menor que) 2 x as DO dos poços de controlo positivo.

Uma leitura ELISA negativa nos poços de controlo positivo indica que o teste não foi efectuado correctamente ou que ocorreram inibições. Uma leitura ELISA positiva nos poços de controlo negativo indica que ocorreu contaminação cruzada ou uma ligação não específica de anticorpos.

9 - Bioensaio:

Nota. - Um ensaio preliminar com este teste deveria permitir a detecção reprodutível de 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) unidades formadoras de colónias de R. solanacearum por ml adicionadas a amostras de extractos para as quais se obtiveram anteriormente resultados negativos (para a preparação, ver apêndice n.º 3).

Pode esperar-se a sensibilidade de detecção mais elevada quando se utiliza uma amostra de extracto recentemente preparada e condições de crescimento óptimas. No entanto, o método pode ser aplicado com sucesso a extractos que tenham sido armazenados em glicerol a uma temperatura compreendida entre 68 e 86ºC.

O protocolo seguinte tem por base Janse (1988):

9.1 - Para cada amostra, utilizar 10 plantas de uma cultivar susceptível de tomateiro (por exemplo «Moneymaker» ou cultivar com susceptibilidade equivalente, determinada pelo laboratório) no estádio de três folhas verdadeiras. Para os pormenores de cultivo, ver apêndice n.º 8. Em alternativa, utilizar beringelas (por exemplo cultivar «Black Beauty» ou cultivares com susceptibilidade equivalente), mas apenas plantas que se encontrem no estádio fenológico de duas a três folhas, até que a terceira folha verdadeira esteja completamente expandida. Tem-se observado que os sintomas são menos graves e se desenvolvem mais lentamente na beringela. Recomenda-se, por conseguinte, a utilização de plântulas de tomateiro, sempre que possível.

9.2 - Distribuir 100 (mi)l de extracto de amostra pelas plantas.

9.2.1 - Inoculação por injecção.

Inocular os caules das plantas imediatamente acima dos cotilédones, utilizando uma seringa com uma agulha hipodérmica (não inferior a 23 G). Distribuir a amostra pelas plantas.

9.2.2 - Inoculação por fenda.

Segurar a planta entre dois dedos, pipetar uma gota (cerca de 5-10 (mi)l) do sedimento ressuspenso no caule, entre os cotilédones e a primeira folha.

Utilizando um escalpelo esterilizado, fazer uma fenda em diagonal com 1,0 cm de comprimento e com uma profundidade de cerca de 2/3 do diâmetro do caule, começando a incisão a partir da gota de sedimento.

Selar o corte com vaselina esterilizada aplicada com uma seringa.

9.3 - Inocular, através da mesma técnica, 5 plântulas com uma suspensão aquosa de 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células por ml preparada a partir de uma cultura de 48 horas de uma estirpe virulenta de R. solanacearum Biovar 2, como controlo positivo, e com tampão de ressuspensão (apêndice n.º 4) como controlo negativo. Separar as plantas de controlo positivo e negativo das outras plantas, a fim de evitar contaminações cruzadas.

9.4 - Deixar crescer as plantas em instalações de quarentena durante um período de até 4 semanas a uma temperatura de 25-30ºC e elevada humidade relativa, regando adequadamente para evitar o alagamento ou a murchidão por falta de água. Para evitar a contaminação, incubar as plantas de controlo positivo e as de controlo negativo em prateleiras claramente separadas numa estufa ou câmara de crescimento ou, caso existam limitações de espaço, garantir uma separação rigorosa. Se as plantas relativas a amostras diferentes tiverem de ser incubadas perto umas das outras, separá-las com as divisórias adequadas. Evitar contaminações cruzadas ao adubar, regar, inspeccionar ou ao proceder a outras manipulações. É essencial manter as estufas ou as câmaras de crescimento isentas de pragas, visto que estas podem promover a transmissão da bactéria entre amostras.

Observar o desenvolvimento de sintomas de murchidão, epinastia, clorose e/ou nanismo.

9.5 - Fazer isolamentos a partir das plantas infectadas (n.º 3 da secção II) e identificar culturas puras de presumíveis colónias de R. solanacearum (parte B da secção VI).

9.6 - Caso não se observem sintomas após 3 semanas, efectuar um teste IF, PCR ou de isolamento numa amostra composta de secções de 1 cm do caule de cada uma das plantas inoculadas com os extractos das amostras, colhidas acima do local da inoculação. Se o teste for positivo, proceder à diluição em placas (n.º 4.1).

9.7 - Identificar culturas puras de presumíveis colónias de R. solanacearum (parte B da secção VI).

Interpretação dos resultados do bioensaio:

Obtêm-se resultados válidos no bioensaio quando as plantas do controlo positivo revelam sintomas típicos, é possível isolar novamente bactérias a partir destas plantas e não se observam sintomas nos controlos negativos.

O bioensaio é negativo se as plantas inoculadas com os extractos das amostras não estiverem infectadas por R. solanacearum e se for detectada R. Solanacearum nos controlos positivos.

O bioensaio é positivo se as plantas inoculadas com os extractos das amostras estiverem infectadas por R.solanacearum.

PARTE B

Testes de identificação

Identificar culturas puras de presumíveis isolados de R solanacearum, utilizando, pelo menos, dois dos seguintes testes baseados em princípios biológicos diferentes.

Incluir estirpes de referência conhecidas, sempre que adequado, para cada teste realizado (ver apêndice n.º 3).

1 - Testes nutricionais e enzimáticos:

Determinar as seguintes características fenotípicas, que estão universalmente presentes ou ausentes em R. solanacearum, de acordo com os métodos de Lelliotte Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001).

Testes ... Resultado esperado

Produção de pigmento fluorescente ... -

Grânulos de poli-(Beta)-hidroxibutirato ... +

Teste de oxidação/fermentação (O/F) ... O+F-

Produção da catalase ... +

Teste de oxidase de Kovac ... +

Redução dos nitratos ... +

Utilização de citrato ... +

Crescimento a 40 ºC ... -

Crescimento em NaCl a 1% ... +

Crescimento em NaCl a 2% ... -

Produção de arginina di-hidrolase ... -

Liquefacção da gelatina ... -

Hidrólise do amido ... -

Hidrólise da esculina ... -

Produção de levana ... -

2 - Teste IF:

2.1 - Preparar uma suspensão com cerca de 10(elevado a 6) células por ml em tampão IF (apêndice n.º 4).

2.2 - Preparar uma série de diluições a 1:2 de um anti-soro adequado (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3 - Aplicar o procedimento de IF (n.º 5 da parte A da secção VI).

2.4 - Um resultado positivo no teste IF é alcançado se o título IF para a cultura em estudo for equivalente ao do controlo positivo.

3 - Teste ELISA:

Nota. - Se se realizarem apenas dois testes de identificação, não deve utilizar-se outro teste serológico como complemento deste teste.

3.1 - Preparar uma suspensão com cerca de 10(elevado a 8) células por ml em 1X PBS (apêndice n.º 4).

3.2 - Utilizar um teste ELISA adequado com um anticorpo monoclonal específico para R. solanacearum.

3.3 - Um resultado positivo no teste ELISA é alcançado se a leitura ELISA obtida para a cultura for, pelo menos, igual a metade da obtida para o controlo positivo.

4 - Testes PCR:

4.1 - Preparar uma suspensão com cerca de 10(elevado a 6) células por ml em água esterilizada UPW.

4.2 - Aquecer 100 (mi)l da suspensão de células em tubos fechados num bloco de aquecimento ou em banho-maria em ebulição a 100ºC durante 4 minutos. As amostras podem, então, ser armazenadas a uma temperatura compreendida entre 16 e 24ºC até serem necessárias.

4.3 - Aplicar os procedimentos PCR adequados para amplificar os fragmentos específicos de R. solanacearum [por exemplo Seal et al. (1993), Pastrik e Maiss (2000), Pastrik et al. (2002), Boudazin et al.(1999), Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)].

4.4 - É alcançada uma identificação positiva para R. solanacearum se os fragmentos de amplificação da PCR tiverem a mesma dimensão e os mesmos polimorfismos dos fragmentos de restrição que a estirpe de controlo positivo.

5 - Teste FISH:

5.1 - Preparar uma suspensão de cerca de 10(elevado a 6) células por ml em UPW.

5.2 - Aplicar o procedimento FISH (n.º 7 da parte A da secção VI) com, pelo menos, duas sondas específicas para R. solanacearum (apêndice n.º 7).

5.3 - Um resultado positivo no teste FISH é alcançado se a cultura apresentar as mesmas reacções do controlo positivo.

6 - Perfis de ácidos gordos (FAP):

6.1 - Incubar o isolado em agar de soja e tripticase (Oxoid) durante 48 horas a 28ºC.

6.2 - Utilizar um procedimento FAP adequado (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3 - Um resultado positivo no teste FAP é alcançado se o perfil do presumível isolado for idêntico ao do controlo positivo. A presença de ácidos gordos característicos 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH e 18:1 2OH e a ausência de 16:0 3OH são altamente indicativas de Ralstonia sp.

7 - Métodos para caracterização da estirpe:

A caracterização da estirpe utilizando um dos métodos seguintes é recomendada para cada novo caso de isolamento de R. solanacearum.

Incluir estirpes de referência conhecidas, sempre que adequado, para cada teste realizado (ver apêndice n.º 3).

7.1 - Determinação do biovar:

A espécie R. solanacearum encontra-se dividida em Biovares com base na sua capacidade em utilizar e/ou oxidar três dissacáridos e três álcoois de hexoses (Hayward, 1964 e Hayward et al., 1990). O meio decrescimento para o teste do Biovar é descrito no apêndice n.º 2. O teste pode ser realizado com sucesso mediante a inoculação por picada dos meios de crescimento com culturas puras de isolados de R. solanacearum e incubação a 28ºC. Se os meios forem distribuídos em placas estéreis de cultura de 96 poços (200 (mi)l por poço) pode observar-se uma mudança de cor, de verde azeitona para amarelo, passadas 72 horas, o que indica um resultado positivo.

(ver documento original)

Testes adicionais diferenciam o Biovar 2 em subfenótipos.

(ver documento original)

7.2 - «Genomic fingerprinting»:

A diferenciação molecular das estirpes do complexo R. solanacearum pode ser efectuada através de várias técnicas, entre as quais são de referir:

7.2.1 - Análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição (RFLP) (Cook et al., 1989).

7.2.2 - PCR de sequências repetitivas utilizando iniciadores REP, BOX e ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3 - Análise do polimorfismo dos fragmentos amplificados (AFLP) (Van der Wolf et al., 1998).

7.3 - Métodos PCR:

Podem utilizar-se iniciadores específicos para PCR (Pastrik et al., 2002; ver apêndice n.º 6) para diferenciar estirpes pertencentes à Divisão 1 (Biovares 3, 4 e 5) e Divisão 2 (Biovares 1, 2A e 2T) de R. solanacearum, como definidas inicialmente pela análise RFLP (Cook et al., 1989) e a sequenciação de 16S rADN (Taghavi et al., 1996).

PARTE C

Teste de confirmação

O teste de patogenicidade tem de ser efectuado como confirmação final do diagnóstico de R. solanacearum e para avaliar a virulência dos isolados identificados como R. solanacearum:

1) Preparar um inóculo de aproximadamente 10(elevado a 6) células por ml de uma cultura com 24-48 horas do isolado a ser testado e de uma estirpe de R. Solanacearum adequada para controlo positivo (por exemplo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ver apêndice n.º 3);

2) Inocular 5-10 plântulas de tomateiro ou beringela susceptíveis no estádio de três folhas verdadeiras (ver n.º 9 da parte A da secção VI);

3) Incubar durante, no máximo, 2 semanas a uma temperatura de 25-28ºC e elevada humidade relativa, regando adequadamente para evitar o alagamento ou a seca. Com culturas puras deve observar-se a murchidão típica no período de 14 dias. Se no final deste período não se observarem quaisquer sintomas, não se pode confirmar que a cultura seja uma forma patogénica de R. Solanacearum;

4) Observar o desenvolvimento de sintomas de murchidão e ou epinastia, clorose e nanismo;

5) Efectuar um isolamento a partir das plantas sintomáticas, retirando-lhes uma secção de cerca de 2 cm de caule acima do ponto de inoculação. Fragmentá-las e suspendê-las num pequeno volume de água destilada esterilizada ou de tampão fosfato 50 mM (apêndice n.º 4). Isolar a partir de diluições apropriadas da suspensão por espalhamento ou reticulado num meio adequado, de preferência selectivo (apêndice n.º 2), incubar durante 48-72 horas a 28ºC e observar a formação de colónias típicas de R. solanacearum.

APÊNDICE N.º 1

Laboratórios envolvidos na validação e optimização de protocolos

(ver documento original)

APÊNDICE N.º 2

Meios para isolamento e cultura de R. Solanacearum

a) Meio geral de crescimento:

Agar nutritivo (NA)

Agar nutritivo (Difco) - 23,0 g

Água destilada - 1,0 l

Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

Agar com extracto de levedura, peptona e glucose (YPGA)

Extracto de levedura (Difco) - 5,0 g

Bacto-Peptona (Difco) - 5,0 g

D(+)glucose mono-hidratada - 10,0 g

Bacto-Agar (Difco) - 15,0 g

Água destilada - 1,0 l

Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

Agar de sacarose e peptona (SPA)

Sacarose - 20,0 g

Bacto-Peptona (Difco) - 5,0 g

K(índice 2)HPO(índice 4) - 0,5 g

MgSO(índice 4) . 7H(índice 2)O - 0,25 g

Bacto-Agar (Difco) - 15,0 g

Água destilada - 1,0 l

pH 7,2-7,4

Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

Meio de tetrazólio de Kelman

Casaminoácidos (Difco) - 1,0 g

Bacto-Peptona (Difco) - 10,0 g

Dextrose - 5,0 g

Bacto-Agar (Difco) - 15,0 g

Água destilada - 1,0 l

Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

Arrefecer até 50ºC e adicionar o volume necessário de solução de cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio (Sigma), esterilizada por filtração, para obter uma concentração final de 50 mg por l.

b) Meios de crescimento selectivo validados:

Meio SMSA (Englebrecht, 1994 modificado por Elphinstone et al., 1996)

Meio basal

Casaminoácidos (Difco) - 1,0 g

Bacto-Peptona (Difco) - 10,0 g

Glicerol - 5,0 ml

Bacto-Agar (Difco), ver Nota 2. - 15,0 g

Água destilada - 1,0 l

Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

Arrefecer até 50ºC e adicionar o volume necessário de soluções aquosas concentradas, esterilizadas por filtração, dos seguintes ingredientes para obter as concentrações finais especificadas:

Violeta cristal (Sigma C-0775) - 5 mg por l

Sulfato de polimixina B (Sigma P-1004) 600000 U (aproximadamente 100 mg) por l

Bacitracina (Sigma B-0125) - 1250 U (aproximadamente 25 mg) por l

Cloranfenicol (Sigma C-3175) - 5 mg por l

Penicilina-G (Sigma P-3032) - 825 U (aproximadamente 0,5 mg) por l

Cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (Sigma T-8877) - 50 mg por l

Nota. - A utilização de reagentes diferentes dos acima especificados pode afectar o crescimento de R. solanacearum.

Pode utilizar-se agar Oxoid #1 em vez de Bacto-agar (Difco). Neste caso, o crescimento de R. solanacearum será mais lento, embora o crescimento dos saprófitas competidores possa também ser reduzido. A formação de colónias típicas de R. solanacearum pode demorar mais 1-2 dias e a coloração vermelha pode ser mais clara e mais difusa do que em Bacto-agar.

O aumento da concentração de bacitracina para 2500 U por l pode reduzir as populações de bactérias competidoras sem afectar o crescimento de R. solanacearum.

Armazenar os meios e as soluções concentradas de antibióticos a 4ºC, no escuro, e utilizar no prazo de um mês.

As placas devem estar livres de condensação superficial antes da utilização.

Evitar a secagem excessiva das placas.

Após a preparação de cada novo lote de meio deve efectuar-se um controlo de qualidade mediante o espalhamento de uma suspensão de uma cultura de referência de R. solanacearum (ver apêndice n.º 3), observando a formação de colónias típicas após incubação a 28ºC durante 2-5 dias.

c) Meios de enriquecimento validados:

Meio líquido SMSA (Elphinstone et al., 1996)

Preparar de forma idêntica à do meio selectivo SMSA contendo agar, mas excluindo o Bacto-agar e o cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio.

Meio líquido de Wilbrink modificado (Caruso et al., 2002)

Sacarose - 10 g

Proteose peptona - 5 g

K(índice 2)HPO(índice 4) - 0,5 g

MgSO(índice 4) - 0,25 g

NANO(índice 3) - 0,25 g

Água destilada - 1 l

Esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos e arrefecer até 50ºC

Adicionar soluções concentradas de antibióticos como para o meio líquido SMSA.

APÊNDICE N.º 3

Parte A

Material de controlo normalizado disponível no mercado

a) Isolados bacterianos:

Recomenda-se a utilização dos seguintes isolados bacterianos como material de referência normalizado, quer como controlos positivos (quadro I) quer durante a optimização de testes para evitar reacções cruzadas (quadro II). Todas as estirpes são comercializadas por:

1) National Collection of Plant Pathogenic Bactéria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, Reino Unido;

2) Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Países Baixos;

3) Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, França.

QUADRO I

Tabela de referência SMT de isolados de R. solanacearum

(ver documento original)

Nota. - A autenticidade das estirpes acima indicadas só pode ser garantida se estas forem obtidas a partir de uma colecção de culturas autênticas.

QUADRO II

Tabela de referência SMT de bactérias serológica ou geneticamente relacionadas para utilização na optimização de testes de detecção

(ver documento original)

b) Material de controlo normalizado disponível no mercado:

O material de controlo seguidamente indicado está disponível na colecção de culturas NCPPB.

Sedimento liofilizado de extracto de batata proveniente de 200 tubérculos de batateira sãos como controlo negativo para todos os testes.

Sedimento liofilizado de extracto de batata proveniente de 200 tubérculos de batateira sãos com 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) e 10(elevado a 4) a 10(elevado a 6) células de R. solanacearum Biovar 2 (estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) como controlo positivo para testes serológicos e PCR. Visto que a viabilidade das células é afectada durante a liofilização, estes controlos não são adequados como controlos normalizados para testes de isolamento ou bioensaio.

Suspensões fixadas em formalina de R. solanacearum Biovar 2 (estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) com 10(elevado a 6) células por ml como controlos positivos para testes serológicos.

PARTE B

Preparação de controlos positivos e negativos para os testes essenciais de rastreio PCR/IF e FISH

Preparar uma suspensão a partir do crescimento de uma cultura com 48 horas em meio basal SMSA de uma estirpe virulenta de R. solanacearum Biovar 2/raça 3 (por exemplo estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) em tampão fosfato 10 mM, de modo a obter uma concentração de, aproximadamente, 2 x 10(elevado a 8) ufc por ml. Esta é obtida, normalmente, com uma suspensão ligeiramente turva equivalente a uma densidade óptica de 0,15 a 600 nm.

Remover os cones dos hilos de 200 tubérculos colhidos de uma variedade de epiderme branca, isenta de R. solanacearum.

Processar os hilos como habitualmente e ressuspender o sedimento em 10 ml.

Preparar 10 microtubos esterilizados de 1,5 ml com 900 (mi)l de sedimento ressuspenso.

Transferir 100 (mi)l da suspensão de R. Solanacearum para o primeiro microtubo. Agitar em vortex.

Utilizar os cinco microtubos seguintes para efectuar uma série de cinco diluições decimais.

Os seis microtubos contaminados serão utilizados como controlos positivos. Os quatro microtubos não contaminados serão utilizados como controlos negativos. Rotular os microtubos em conformidade.

Preparar alíquotas de 100 (mi)l em microtubos esterilizados de 1,5 ml, obtendo assim nove réplicas de cada amostra de controlo. Armazenar a uma temperatura compreendida entre 16 e 24ºC até à sua utilização.

A presença e a quantificação de R. Solanacearum nas amostras de controlo devem ser primeiro confirmadas por IF.

Para o teste PCR efectuar a extracção de ADN das amostras de controlo positivo e negativo para cada série de amostras a testar.

Para os testes IF e FISH efectuar ensaios nas amostras de controlo positivo e negativo para cada série de amostras a testar.

Para os testes IF, FISH e PCR, deve detectar-se R. solanacearum, pelo menos, nas amostras de controlo positivo com 10(elevado a 6) e 10(elevado a 4) células por ml e não deve ser detectada em nenhum controlo negativo.

APÊNDICE N.º 4

Tampões para a realização dos testes

Geral:

Os tampões esterilizados não abertos podem ser armazenados durante 1 ano.

1 - Tampões para extracção:

1.1 - Tampão de extracção (tampão fosfato 50 mM, pH 7,0):

Este tampão é utilizado para a extracção da bactéria dos tecidos vegetais por homogeneização ou agitação.

Na(índice 2)HPO(índice 4) (anidro) - 4,26 g

KH(índice 2)PO(índice 4) - 2,72 g

Água destilada - 1,00 l

Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

Os seguintes componentes adicionais podem também ser úteis:

(ver documento original)

1.2 - Tampão de ressuspensão (tampão fosfato 10 mM, pH 7,2):

Este tampão é utilizado para a ressuspensão e diluição dos extractos dos hilos do tubérculo da batateira após a sua concentração por centrifugação.

Na(índice 2)HPO(índice 4) . 12H(índice 2)O - 2,7 g

NaH(índice 2)PO(índice 4) . 2H(índice 2)O - 0,4 g

Água destilada - 1,0 l

Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

2 - Tampões para o teste IF:

2.1 - Tampão IF (tampão fosfato salino (PBS) 10 mM, pH 7,2):

Este tampão é utilizado para a diluição dos anticorpos.

Na(índice 2)HPO(índice 4) . 12H(índice 2)O - 2,7 g

NaH(índice 2)PO(índice 4) . 2H(índice 2)O - 0,4 g

NaCl - 8,0 g

Água destilada - 1,0 l

Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

2.2 - Tampão IF-Tween:

Este tampão é utilizado para lavagem das lâminas.

Adicionar 0,1% de Tween 20 ao tampão IF.

2.3 - Tampão fosfato com glicerol, pH 7,6:

Este tampão é utilizado como líquido de montagem nos poços das lâminas de IF para aumentar a fluorescência.

Na(índice 2)HPO(índice 4) . 12H(índice 2)O - 3,2 g

NaH(índice 2)PO(índice 4) . 2H(índice 2)O - 0,15 g

Glicerol - 50 ml

Água destilada - 100 ml

Estão disponíveis no mercado soluções de montagem para evitar a rápida perda de fluorescência, como sejam, por exemplo, Vectashield(R) (Vector Laboratories) ou Citifluor(R) (Leica).

3 - Tampões para o teste ELISA indirecto:

3.1 - Tampão de revestimento de dupla concentração, pH 9,6:

Na(índice 2)CO(índice 3) - 6,36 g

NaHCO(índice 3) - 11,72 g

Água destilada - 1,00 l

Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

Pode ser acrescentado sulfito de sódio (0,2%) como antioxidante, se for necessário para evitar a acumulação de compostos aromáticos oxidados.

3.2 - Tampão fosfato salino (PBS) 10x, pH 7,4:

NaCl - 80,0 g

KH(índice 2)PO(índice 4) - 2,0 g

Na(índice 2)HPO(índice 4) . 12H(índice 2)O - 29,0 g

KCl - 2,0 g

Água destilada - 1,0 l

3.3 - PBS-Tween:

PBS 10x - 100 ml

Tween 20 a 10% - 5 ml

Água destilada - 895 ml

3.4 - Tampão de bloqueio (anticorpo) - deve ser preparado na altura da utilização:

PBS 10x - 10,0 ml

Polivinilpirrolidona-44000 (PVP-44) - 2,0 g

Tween 20 a 10% - 0,5 ml

Leite em pó - 0,5 g

Água destilada - Perfazer 100 ml

3.5 - Solução de substrato de fosfatase alcalina, pH 9,8:

Dietanolamina - 97 ml

Água destilada - 800 ml

Misturar e acertar a pH 9,8 com HCl concentrado.

Perfazer o volume até 1l com água destilada.

Juntar 0,2 g de MgCl(índice 2).

Dissolver duas pastilhas de 5 mg cada de substrato de fosfatase alcalina (Sigma) por cada 15 ml de solução.

4 - Tampões para o teste DASI ELISA:

4.1 - Tampão de revestimento, pH 9,6:

Na(índice 2)CO(índice 3) - 1,59 g

NaHCO(índice 3) - 2,93 g

Água destilada - 1000 ml

Dissolver os ingredientes e verificar o pH 9,6.

4.2 - Tampão fosfato salino (PBS) 10x, pH 7,2-7,4:

NaCl - 80,0 g

NaH(índice 2)PO(índice 4) . 2H(índice 2)O - 4,0 g

Na(índice 2)HPO(índice 4) . 12H(índice 2)O - 27,0 g

Água destilada - 1000 ml

4.3 - PBS-Tween:

PBS 10x - 50 ml

Tween 20 a 10% - 5 ml

Água destilada - 950 ml

4.4 - Tampão de substrato, pH 9,8:

Dietanolamina - 100 ml

Água destilada - 900 ml

Misturar e acertar a pH 9,8 com HCl concentrado.

APÊNDICE N.º 5

Determinação do nível de contaminação em testes IF e FISH

1 - Determinar o número médio de células fluorescentes típicas por campo de observação (c).

2 - Calcular o número de células fluorescentes típicas por poço de lâmina de microscópio (C).

C = c x S/s

Em que:

S = área da superfície de cada poço da lâmina multiteste, e

s = área da superfície do campo da objectiva

s = (pi)i(elevado a 2)/4G(elevado a 2)K(elevado a 2)

Em que:

i = coeficiente de campo (varia entre 8 e 24, dependendo do tipo de ocular)

K = coeficiente do tubo (1 ou 1,25)

G = ampliação da objectiva (l00x, 40x, etc.)

3 - Calcular o número de células fluorescentes típicas por ml de sedimento ressuspenso (N).

N = C x 1000/y x F

Em que:

y = volume de sedimento ressuspenso em cada poço, e

F = factor de diluição do sedimento ressuspenso

APÊNDICE N.º 6

Protocolos e reagentes validados para PCR

Nota. - Os testes preliminares deveriam permitir a detecção reprodutível de 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células de R. solanacearum por ml de extracto de amostra.

Os testes preliminares não deveriam ainda revelar nenhum resultado falso positivo com um painel de estirpes bacterianas seleccionadas (ver apêndice n.º 3).

1 - Protocolo PCR de Seal et al. (1993):

1.1 - Iniciadores:

Iniciador directo OLI-1 - 5'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3'

Iniciador inverso Y-2 - 5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'

Tamanho esperado do fragmento amplificado do ADN-alvo de R. solanacearum = 288 bp.

1.2 - Mistura de reacção da PCR:

1.3 - Condições de reacção da PCR:

(ver documento original)

Correr o seguinte programa:

1 ciclo de:

i) 2 minutos a 96ºC (desnaturação do ADN-alvo)

35 ciclos de:

ii) 20 segundos a 94ºC (desnaturação do ADN-alvo)

iii) 20 segundos a 68ºC (emparelhamento dos iniciadores)

iv) 30 segundos a 72ºC (extensão da cópia)

1 ciclo de:

v) 10 minutos a 72ºC (extensão final)

vi) Manter a uma temperatura de 4ºC

Nota. - Este programa foi optimizado para utilização com um termociclador Perkin Elmer 9600. Para a utilização com outros modelos pode ser necessária a alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv).

1.4 - Análise de restrição enzimática do fragmento amplificado:

Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum produzem um polimorfismo dos fragmentos de restrição característico com a enzima Ava II após incubação a 37ºC.

2 - Protocolo PCR de Pastrik e Maiss (2000):

2.1 - Iniciadores:

Iniciador directo Ps-1 - 5'-AGT CGA ACG GCA GCG GGG G-3

Iniciador inverso Ps-2 - 5'-GGG GAT TTC ACA TCG GTC TTG CA-3'

Tamanho esperado do fragmento amplificado de ADN-alvo de R. solanacearum = 553 bp.

2.2 - Mistura de reacção da PCR:

(ver documento original)

2.3 - Condições de reacção da PCR:

Correr o seguinte programa:

1 ciclo de:

i) 5 minutos a 95ºC (desnaturação do ADN-alvo)

35 ciclos de:

ii) 30 segundos a 95ºC (desnaturação do ADN-alvo)

iii) 30 segundos a 68ºC (emparelhamento dos iniciadores)

iv) 45 segundos a 72ºC (extensão da cópia)

1 ciclo de:

v) 5 minutos a 72ºC (extensão final)

vi) Manter a uma temperatura de 4ºC

Nota. - Este programa foi optimizado para utilização com um termociclador MJ Research PTC 200. Para a utilização com outros modelos pode ser necessária a alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv).

2.4 - Análise de restrição enzimática do fragmento amplificado:

Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum produzem um polimorfismo do fragmento de restrição característico com a enzima Taq I após incubação a 65ºC durante 30 minutos. Os fragmentos de restrição obtidos de um fragmento específico de R. solanacearum têm tamanhos de 457 bp e 96 bp.

3 - Protocolo PCR Multiplex com controlo interno (Pastrik et al., 2002):

3.1 - Iniciadores:

Iniciador directo RS-1-F - 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'

Iniciador inverso RS-1-R - 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'

Iniciador directo NS-5-F - 5'-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3'

Iniciador inverso NS-6-R - 5'-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3'

Tamanho esperado do fragmento amplificado de ADN-alvo de R. solanacearum = 718 bp (conjunto iniciador RS).

Tamanho esperado do fragmento amplificado do controlo interno da PCR de 18S rARN = 310 bp (conjunto iniciador NS).

3.2 - Mistura de reacção da PCR:

(ver documento original)

3.3 - Condições de reacção da PCR:

Correr o seguinte programa:

1 ciclo de:

i) 5 minutos a 95ºC (desnaturação do ADN-alvo)

35 ciclos de:

ii) 30 segundos a 95ºC (desnaturação do ADN-alvo)

iii) 30 segundos a 58ºC (emparelhamento dos iniciadores)

iv) 45 segundos a 72ºC (extensão da cópia)

1 ciclo de:

v) 5 minutos a 72ºC (extensão final)

vi) Manter a uma temperatura de 4ºC

Nota. - Este programa foi optimizado para utilização com um termociclador MJ Research PTC 200. Para a utilização com outros modelos pode ser necessária a alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv).

3.4 - Análise de restrição enzimática do fragmento amplificado:

Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum produzem um polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição característico com a enzima Bsm I ou um isosquizómero (e.g. Mva 1269 I) após incubação a 65ºC durante 30 minutos.

4 - Protocolo PCR específico para os Biovares de R. solanacearum (Pastrik et al, 2001):

4.1 - Iniciadores:

Iniciador directo Rs-1-F - 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'

Iniciador inverso Rs-1-R - 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'

Iniciador inverso Rs-3-R - 5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3'

Tamanho esperado do fragmento amplificado de ADN-alvo de R. solanacearum:

Com Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp;

Com Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp.

4.2 - Mistura de reacção da PCR:

a) PCR específica para os Biovares 1 e 2:

(ver documento original)

b) PCR específica para os Biovares 3, 4 e 5:

(ver documento original)

4.3 - Condições de reacção da PCR:

Correr o seguinte programa para as reacções específicas dos Biovares 1/2 e 3/4/5:

1 ciclo de:

i) 5 minutos a 95ºC (desnaturação do ADN-alvo)

35 ciclos de:

ii) 30 segundos a 95ºC (desnaturação do ADN-alvo)

iii) 30 segundos a 58ºC (emparelhamento dos iniciadores)

iv) 45 segundos a 72ºC (extensão da cópia)

1 ciclo de:

v) 5 minutos a 72ºC (extensão final)

vi) Manter a uma temperatura de 4ºC

Nota. - Este programa foi optimizado para utilização com um termociclador MJ Research PTC 200. Para a utilização com outros modelos pode ser necessária a alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv).

4.4 - Análise de restrição enzimática do fragmento amplificado:

Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum utilizando os iniciadores Rs-1-F e Rs-1-R produzem um polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição característico com a enzima Bsm I ou um isosquizómero (por exemplo Mva 1269 I) após incubação a 65ºC durante 30 minutos. Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum utilizando os iniciadores Rs-1-F e Rs-3-R não apresentam locais de restrição.

5 - Preparação do tampão de carregamento:

5.1 - Azul de bromofenol (solução concentrada a 10%):

Azul de bromofenol - 5 g

Água destilada (bidest) - 50 ml

5.2 - Tampão de carregamento:

Glicerol (86%) - 3,5 ml

Azul de bromofenol (5.l) - 300 (mi)l

Água destilada (bidest) - 6,2 ml

6 - Tampão de tris acetato EDTA (TAE) 10X, pH 8,0:

Tampão tris - 48,40 g

Ácido acético glacial - 11,42 ml

EDTA (sal dissódico) - 3,72 g

Água destilada - 1,00 l

Diluir até 1x antes de utilizar.

Também disponível comercialmente (por exemplo, Invitrogen ou equivalente).

APÊNDICE N.º 7

Reagentes validados para o teste FISH

1 - Sondas:

Sonda específica para R. solanacearum OLI-1-CY3: 5'-GGC AGG TAG CAA GCT ACC CCC-3';

Sonda para eubactérias (não específica) EUB-338-FITC: 5'-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'.

2 - Solução fixadora:

Nota. - Atenção! O fixador contém paraformaldeído, um produto tóxico. Utilizar luvas e não inalar. É aconselhável trabalhar em «hotte».

i) Aquecer 9 ml de água de grau molecular [por exemplo água ultra pura (UPW)] a cerca de 60ºC e adicionar 0,4 g de paraformaldeído. O paraformaldeído dissolve-se após a adição de 5 gotas de NaOH 1N e a agitação com um agitador magnético;

ii) Ajustar o pH a 7,0 mediante adição de 1 ml de tampão fosfato 0,1 M (PB, pH 7,0) e 5 gotas de HCl 1N. Verificar o pH com papel indicador e ajustar, se necessário, com HCl ou NaOH;

Nota. - Atenção! Não utilizar um medidor de PH em soluções contendo paraformaldeído.

iii) Filtrar a solução através de um filtro de membrana de 0,22 (mi)m e manter ao abrigo de poeiras a 4ºC até à sua utilização.

3 - «Hybmix» 3x:

NaCl - 2,7 M

Tris-HCl - 60 mM (pH 7,4)

EDTA (esterilizado por filtração e autoclavado) - 15 mM

Diluir até 1x, conforme necessário.

4 - Solução de hibridação:

«Hybmix» 1x

Dodecilsulfato de sódio (SDS) - 0,01%

Formamida - 30%

Sonda EUB 338 - 5 ng/(mi)l

Sonda OLI-1 ou OLI-2 - 5 ng/(mi)l

Preparar quantidades de solução de hibridação de acordo com os cálculos do quadro I. Para cada lâmina (contendo 2 amostras diferentes em duplicado) são necessários 90 (mi)l de solução de hibridação.

Nota. - Atenção! A formamida é muito tóxica. Utilizar luvas e tomar as medidas de segurança necessárias!

QUADRO I

Quantidades sugeridas para a preparação da solução de hibridação

(ver documento original)

5 - Tampão fosfato 0,1 M, pH 7,0:

Na(índice 2)HPO(índice 4) - 8,52 g

KH(índice 2)PO(índice 4) - 5,44 g

Água destilada - 1,00 l

Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

APÊNDICE N.º 8

Condições de cultivo de beringela e tomateiro

Semear tomateiros (Lycopersicon esculentum) ou beringelas (Solanum melongena) em tabuleiros com substrato pasteurizado. O transplante das plântulas faz-se quando os cotilédones estão completamente expandidos (10 a 14 dias), para substrato de cultura pasteurizado.

As beringelas ou os tomateiros devem ser cultivados em estufa nas seguintes condições ambientais antes da inoculação:

(ver documento original)

Fornecedores:

ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Referências bibliográficas

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21 - Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

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24 - Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.

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28 - Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.

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30 - Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.

ANEXO III

Ocorrência suspeita e confirmação da presença do organismo prejudicial

1 - Sempre que, em caso de ocorrência suspeita, para os materiais vegetais da lista e para todos os outros casos, surja um resultado positivo no ou nos testes de rastreio efectuados em conformidade com os métodos pertinentes constantes do anexo II, e se aguarde a confirmação ou refutação através da conclusão dos referidos métodos, deve proceder-se à retenção e conservação adequada, até à conclusão dos referidos métodos, de:

1.1 - Todos os tubérculos e, sempre que possível, todas as plantas sujeitas a amostragem;

1.2 - Qualquer extracto restante e outro material preparado para o(s) teste(s) de rastreio, por exemplo, lâminas de imunofluorescência; e

1.3 - Toda a documentação relevante.

Nota. - A retenção dos tubérculos permite a realização, sempre que necessária, do teste de variedade.

2 - Em caso de confirmação da presença do organismo prejudicial, deve-se proceder à retenção e conservação adequada, durante pelo menos um mês após a comunicação referida no n.º 2 do artigo 6.º:

2.1 - Do material referido no n.º 1;

2.2 - De uma amostra de material infectado de tomateiro ou de beringela inoculada com o extracto do tubérculo ou da planta, se for caso disso; e

2.3 - De uma cultura isolada do organismo prejudicial.

ANEXO IV

Elementos da investigação para a determinação da extensão e da fonte primária da contaminação

1 - Os elementos da investigação referida na subalínea i) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, devem incluir, sempre que relevante:

1.1 - Locais de produção que:

1.1.1 - Em que se cultive ou tenha cultivado batata que tenha uma relação clonal com batata que se verificou estar contaminada pelo organismo prejudicial;

1.1.2 - Em que se cultive ou tenha cultivado tomate da mesma origem que o tomate que se verificou estar contaminado pelo organismo prejudicial;

1.1.3 - Em que se cultive ou se tenha cultivado batata ou tomate que tenham sido colocados sob controlo oficial por se suspeitar da ocorrência do organismo prejudicial;

1.1.4 - Em que se cultive ou tenha cultivado batata que tenha uma relação clonal com batata cultivada em locais de produção que se verificou estarem contaminados pelo organismo prejudicial;

1.1.5 - Em que se cultive batata ou tomate e que estejam localizados na vizinhança de locais de produção contaminados pelo organismo prejudicial, incluindo os locais de produção que partilhem entre si equipamentos e instalações de produção, directamente ou através de um contratante comum;

1.1.6 - Em que se utilizem, para irrigação ou aspersão, águas superficiais provenientes de qualquer ponto de que água de que se suspeite ou esteja confirmada a contaminação pelo organismo prejudicial;

1.1.7 - Em que se utilizem, para irrigação ou aspersão, águas superficiais provenientes de um ponto de água partilhado com locais de produção de que se suspeite ou esteja confirmada a contaminação pelo organismo prejudicial;

1.1.8 - Que estejam ou tenham sido inundados por águas superficiais de que se suspeite ou esteja confirmada a contaminação pelo organismo prejudicial; e

1.2 - Águas superficiais utilizadas para irrigação ou aspersão do ou dos campos ou locais de produção que esteja confirmada a contaminação pelo organismo prejudicial, ou que tenham inundado os mesmos.

ANEXO V

Determinação da extensão da contaminação provável e da possível dispersão do organismo prejudicial

1 - Os elementos a considerar na determinação da extensão da contaminação provável nos termos da subalínea iii) da alínea b) e da subalínea iii) da alínea d)do n.º 1 do artigo 6.º, devem incluir:

1.1 - Os materiais vegetais cultivados num local de produção que tenha sido declarado contaminado ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º;

1.2 - Os locais de produção com alguma relação de produção com os materiais vegetais declarados contaminados ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, incluindo os que partilham equipamentos e instalações de produção, directamente ou através de um contratante comum;

1.3 - Os materiais vegetais produzidos nos locais de produção referidos no número anterior, ou que tenham estado presentes nesses locais durante o período em que os materiais vegetais declarados contaminados ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º se encontravam no local de produção referido no n.º 1.1;

1.4 - Instalações nas quais se manuseiem os materiais vegetais provenientes dos locais de produção referidos nos números anteriores,

1.5 - Quaisquer máquinas, veículos, recipientes, armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, incluindo material de embalagem, que possam ter estado em contacto com os materiais vegetais declarados contaminados ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º;

1.6 - Quaisquer materiais vegetais que tenham estado armazenados em, ou em contacto com, qualquer das estruturas ou objectos referidos no número anterior, antes da limpeza e desinfecção dessas estruturas e objectos;

1.7 - Em resultado das investigações e testes referidos na subalínea i) da alínea b) do nn.º 1 do artigo 6.º, no caso da batata, os tubérculos ou plantas que tenham uma relação clonal colateral ou parental e, no caso do tomate, as plantas que tenham a mesma origem que os materiais vegetais declarados contaminados ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º e em relação aos quais, embora os testes se tenham revelado negativos no que diz respeito ao organismo prejudicial, a contaminação se afigure provável através de uma ligação clonal, sendo que o teste de variedade pode ser efectuado no sentido de verificar a identidade dos tubérculos ou plantas contaminados que tenham uma relação clonal;

1.8 - Locais de produção dos materiais vegetais referidos no número anterior;

1.9 - Locais de produção dos materiais vegetais que tenham usado, para irrigação ou aspersão, águas declaradas contaminadas ao abrigo da subalínea ii) da alínea d) do n.º 1 do artigo 6.º;

1.10 - Materiais vegetais produzidos em campos inundados por águas superficiais de que esteja confirmada a contaminação.

2 - Os elementos a considerar para determinar a possível dispersão ao abrigo da subalínea iv) da alínea b) e da subalínea iii) da alínea d) do n.º 1 do artigo 6.º, devem incluir:

2.1 - Nos casos abrangidos pela subalínea iv) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º:

2.1.1 - A proximidade de outros locais de produção que cultivem materiais vegetais;

2.1.2 - A produção ou utilização comuns de lotes de batata-semente;

2.1.3 - Os locais de produção que utilizam águas superficiais para irrigação ou aspersão dos materiais vegetais, nos casos em que haja ou tenha havido risco de escorrência ou de inundação por essas águas a partir de locais de produção declarados contaminados ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º,

2.2 - Nos casos em que as águas superficiais tenham sido declaradas contaminadas ao abrigo da subalínea ii) da alínea d) do n.º 1 do artigo 6.º:

2.2.1 - Os locais de produção em que sejam produzidos materiais vegetais adjacentes a, ou que estejam em perigo de ser inundados por águas superficiais declaradas contaminadas;

2.2.2 - Qualquer bacia de irrigação distinta que esteja associada às águas superficiais declaradas contaminadas;

2.2.3 - Massas de água ligadas às águas superficiais declaradas contaminadas tendo em conta:

a) A direcção e o caudal das águas declaradas contaminadas;

b) A presença de plantas solanáceas silvestres hospedeiras.

3 - A comunicação a que se refere o n.º 2 do artigo 6.º contém os seguintes dados:

3.1 - Imediatamente após a presença do organismo prejudicial ter sido confirmada por testes laboratoriais, com recurso aos métodos estabelecidos no anexo II, pelo menos:

3.1.1 - No caso da batata:

a) O nome da variedade do lote;

b) O tipo (consumo, semente, etc.) e, sempre que aplicável, a categoria da batata-semente.

3.1.2 - No caso das plantas de tomateiro, o nome da variedade do lote e, sempre que aplicável, a categoria.

3.2 - Sem prejuízo da exigência de comunicação dos casos de ocorrência suspeita prevista no n.º 3 do artigo 5.º, após uma ocorrência confirmada e sempre que exista um risco de contaminação dos materiais vegetais provenientes ou com destino a outros Estados membros deve ser comunicada de imediato à Comissão Europeia e aos organismos responsáveis dos Estados membros em questão, a seguinte informação:

3.2.1 - O nome da variedade do lote de batata ou de tomate;

3.2.2 - O nome e endereço do expedidor e do destinatário;

3.2.3 - A data da entrega do lote de batata ou de tomate;

3.2.4 - A dimensão do lote de batata ou de tomate entregue;

3.2.5 - Uma cópia do passaporte fitossanitário ou, pelo menos, o número do passaporte fitossanitário, sempre que adequado, ou se for o caso, o número do registo do produtor ou comerciante e uma cópia da nota de entrega.

4 - A comunicação adicional a que se refere o n.º 3 do artigo 6.º contém os seguintes dados:

4.1 - Para cada caso e após a conclusão de todas as investigações:

4.1.1 - A data de confirmação da contaminação;

4.1.2 - Uma descrição sucinta da investigação efectuada para identificar a fonte e a possível dispersão da contaminação, incluindo o nível de amostragem efectuado;

4.1.3 - Informação sobre as fontes de contaminação identificadas ou presumidas;

4.1.4 - Pormenores sobre a extensão da contaminação declarada, incluindo o número de locais de produção e, no caso da batata, o número de lotes, com a indicação da variedade e, caso se trate de batata-semente, da categoria;

4.1.5 - Pormenores relativos à demarcação da zona, incluindo o número de locais de produção, não declarados como contaminados mas incluídos na zona;

4.1.6 - Pormenores relativos às águas declaradas, incluindo o nome e a localização da massa de água e a extensão das águas declaradas proibidas para irrigação;

4.1.7 - Para qualquer remessa ou lote de plantas de tomateiro declarado contaminado, o número de passaporte fitossanitário e os certificados fitossanitários ou certificado fitossanitário de reexportação, em conformidade, respectivamente com o disposto no n.º 2.2 da secção I da parte A e na secção I da parte B do anexo V do Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro;

4.1.8 - Quaisquer outras informações relacionadas com o ou os surtos confirmados que a Comissão Europeia venha a solicitar.

ANEXO VI

Aplicação de medidas de protecção fitossanitária sob controlo oficial

1 - As medidas sob controlo oficial a que se refere a que se refere o n.º 1 do artigo 7.º, consistem:

1.1 - Na utilização para a alimentação animal após tratamento térmico que garanta a impossibilidade de sobrevivência do organismo prejudicial; ou

1.2 - Na eliminação num local de eliminação de resíduos destinado especificamente a esse efeito e oficialmente aprovado em que não existam riscos identificáveis de fuga do organismo prejudicial para o meio ambiente, por exemplo, através de escorrência para terras agrícolas, ou do contacto com pontos de água que possam ser utilizados para irrigação de terras agrícolas; ou

1.3 - Na incineração; ou

1.4 - Na transformação industrial através de entrega directa e imediata a uma unidade de transformação com instalações de eliminação de resíduos oficialmente aprovadas, relativamente aos quais se tenha concluído pela não existência de qualquer risco identificável de dispersão do organismo prejudicial, e dotadas de um sistema de limpeza e desinfecção, pelo menos, dos veículos de transporte que saem da referida unidade; ou

1.5 - Noutras medidas, desde que se tenha concluído que não existe qualquer risco identificável de dispersão do organismo prejudicial, sendo essas medidas, bem como a respectiva justificação, comunicadas à Comissão Europeia e aos restantes Estados membros.

1.6 - Em que quaisquer resíduos remanescentes associados às opções indicadas nos números anteriores, e que resultem das mesmas, são eliminados por métodos oficialmente aprovados em conformidade como disposto no anexo VII.

2 - A utilização ou eliminação adequada dos materiais vegetais a que se refere o n.º 2 do artigo 7.º, sob controlo dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente, e se for o caso, com a devida comunicação aos serviços de inspecção das outras DRAP envolvidas de forma a garantir esse controlo a todo o momento, bem como, se for caso disso, mediante aprovação pelo organismo oficial responsável do Estado membro a que batata se destine e no qual irá ser embalada ou transformada, no que diz respeito às instalações de eliminação de resíduos a que se referem os n.os 1.1 e 1.2, é:

2.2 - Quanto aos tubérculos de batata:

2.1.2 - Para utilização como batata consumo, embalada para entrega e utilização directa, sem mudança de embalagem, num local com instalações de eliminação de resíduos adequadas, sendo que as batatas destinadas à plantação apenas podem ser manuseadas no mesmo local, se tal for feito separadamente ou após limpeza e desinfecção; ou

2.1.2 - Para utilização como batata consumo para transformação industrial e destinada a entrega directa e imediata a uma unidade de transformação com instalações adequadas de eliminação de resíduos e um sistema de limpeza e desinfecção, pelo menos, dos veículos de transporte que saem da referida unidade; ou

2.1.3 - Para qualquer outra utilização ou forma de eliminação, desde que seja comprovado que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo prejudicial e sob reserva de aprovação pelos serviços de inspecção fitossanitária da DRA competente.

2.2 - Quanto a outras partes das plantas, incluindo resíduos de caules e folhas:

2.2.1 - Para destruição; ou

2.2.2 - Para qualquer outra utilização ou forma de eliminação, desde que seja comprovado que não existe risco reconhecido de dispersão do organismo prejudicial, e sob reserva de aprovação pelos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente.

3 - Os métodos adequados para descontaminação dos objectos referidos no n.º 3 do artigo 7.º são a limpeza e, quando necessário, desinfecção, de forma a garantir que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo prejudicial, devendo a sua aplicação ter lugar sob supervisão dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente.

4 - A série de medidas a aplicar pelos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente nas zonas demarcadas, estabelecidas ao abrigo da subalínea iv) da alínea b) e da subalínea iii) da alínea d)do n.º 1 do artigo 6.º, e a que se refere o n.º 4 do artigo 7.º, inclui as seguintes acções:

4.1 - Nos casos em que os locais de produção tenham sido declarados contaminados ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º:

4.1.1 - Nos campos ou unidades de produção de culturas protegidas declarados contaminados ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, é aplicada uma das seguintes opções:

4.1.1.1 - Durante, pelo menos, os quatro períodos de cultura subsequentes à declaração de contaminação:

a) São tomadas medidas para a eliminar as plantas espontâneas de batateira ou de tomateiro, bem como outras plantas hospedeiras do organismo prejudicial, incluindo solanáceas infestantes; e

b) Não podem ser plantados:

i) Tubérculos, plantas nem sementes verdadeiras de batateira;

ii) Sementes nem plantas de tomateiro;

iii) Outras plantas hospedeiras;

iv) Plantas de espécies do género Brassica para as quais exista um risco reconhecido de sobrevivência do organismo prejudicial;

v) Culturas para as quais exista um risco reconhecido de dispersão do organismo prejudicial.

c) Na primeira época de colheita de batata ou tomate subsequente ao período especificado na alínea anterior, e sob condição de o campo ter sido considerado livre de plantas espontâneas de batateira ou de tomateiro e de outras plantas hospedeiras, incluindo solanáceas infestantes, durante inspecções oficiais em, pelo menos, dois períodos de cultura consecutivos anteriores à plantação:

i) No caso da batata, apenas será permitida a produção de batata consumo;

ii) No caso da batata e do tomate, os tubérculos colhidos ou as plantas de tomateiro, conforme adequado, devem ser testados em conformidade com o procedimento referido no anexo II.

d) Na época de colheita de batata ou de tomate seguinte à referida na alínea anterior, e após um ciclo de rotação adequado, que é de dois anos, no mínimo, se se pretender cultivar batata-semente, é efectuada uma prospecção oficial nos termos do artigo 3.º;

4.1.2.2 - Durante os cinco anos de cultura subsequentes ao da declaração de contaminação:

a) São tomadas medidas para eliminar as plantas espontâneas de batateira ou de tomateiro, bem como outras plantas hospedeiras naturais do organismo prejudicial, incluindo solanáceas infestantes; e

b) O campo é tratado e mantido, durante os primeiros três anos, em pousio completo ou plantado com cereais de acordo com o risco reconhecido, ou como pastagem permanente, com frequentes cortes ou com pastorícia intensiva, ou plantado com gramíneas destinadas à produção de semente, a que se seguirão dois anos em que serão plantadas plantas que não sejam hospedeiras do organismo prejudicial e para as quais não exista um risco reconhecido de sobrevivência ou dispersão do organismo prejudicial;

c) Na primeira época de colheita de batata ou tomate subsequente ao período especificado na alínea anterior, e sob condição de o campo ter sido considerado livre de plantas espontâneas de batateira ou de tomateiro e de outras plantas hospedeiras do organismo prejudicial, incluindo solanáceas infestantes, durante inspecções oficiais em, pelo menos, dois anos de cultura consecutivos anteriores à plantação:

i) No caso da batata, será permitida a produção de batata-semente ou batata consumo;

ii) Os tubérculos colhidos ou as plantas de tomateiro, conforme adequado, devem ser testados em conformidade com o procedimento referido no anexo II.

4.1.2 - Em todos os restantes campos do local de produção contaminado e sob condição de os serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente obterem a garantia de que foi eliminado o risco de aparecimento de plantas espontâneas de batateira e de tomateiro e de outras plantas hospedeiras naturais do organismo prejudicial, incluindo solanáceas infestantes, quando apropriado:

4.1.2.1 - No ano de cultura subsequente ao da declaração de contaminação:

a) Não são plantados tubérculos, plantas ou sementes verdadeiras de batateira nem qualquer outra planta que possa constituir um hospedeiro do organismo prejudicial; ou

b) No caso de tubérculos de batata, só podem ser plantados tubérculos de batata-semente certificada, unicamente para produção de batata consumo;

c) No caso de plantas de tomateiro, só podem ser plantadas, unicamente para produção de tomate, plantas de tomateiro obtidas de sementes que cumpram as exigências do Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro.

4.1.2.2 - No segundo ano de cultura subsequente ao da declaração de contaminação:

a) No caso da batata, só são plantadas, para produção de batata-semente ou batata consumo, batatas-semente certificadas ou oficialmente testadas para determinar a ausência do organismo prejudicial e cultivadas sob controlo oficial em locais de produção, à excepção dos indicados no n.º 4.1;

b) No caso do tomate, só são plantadas, para produção de plantas ou de tomate, plantas de tomateiro obtidas de sementes que cumpram as exigências do Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro, ou, no caso de propagação vegetativa, de plantas de tomateiro produzidas a partir dessas sementes e cultivadas sob controlo oficial em locais de produção, à excepção dos indicados no n.º 4.1.

4.1.2.3 - Pelo menos no terceiro ano de cultura subsequente ao da declaração de contaminação:

a) No caso da batata, só são plantadas, para produção de batata-semente ou batata consumo, batatas-semente certificadas ou produzidas, sob controlo oficial, a partir de batatas-semente certificadas;

b) No caso do tomate, só podem ser plantadas, para produção de plantas ou de tomate, plantas de tomateiro obtidas de sementes que cumpram as exigências do Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro, ou plantas de tomateiro produzidas sob controlo oficial a partir dessas plantas.

4.1.2.4 - Em cada um dos anos de cultivo referidos nos números anteriores, são tomadas medidas para eliminar as plantas espontâneas de batateira e outras plantas hospedeiras naturais do organismo prejudicial, caso estejam presentes, e proceder-se-á, em alturas apropriadas, a uma inspecção oficial da cultura em desenvolvimento e, em cada campo de cultivo de batata, ao teste oficial das batatas colhidas, em conformidade com o procedimento estabelecido no anexo II.

4.1.3 - Imediatamente após a declaração de contaminação ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, e após o primeiro ano de cultura subsequente:

4.1.3.1 - Todas as máquinas e instalações de armazenamento do local de produção que estejam envolvidas na produção de batata ou tomate devem ser limpas e, quando necessário, desinfectadas através de métodos apropriados conforme especificado no n.º 3;

4.1.3.2 - São estabelecidos, quando necessário, controlos oficiais dos programas de irrigação e aspersão, os quais podem conduzir à sua proibição, para evitar a dispersão do organismo prejudicial.

4.1.4 - Numa unidade de produção de culturas protegidas declarada contaminada ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, nos caso sem que seja possível a total substituição do meio de cultura:

4.1.4.1 - Não são plantados tubérculos nem plantas ou sementes verdadeiras de batateira, nem nenhuma outra planta hospedeira do organismo prejudicial, incluindo plantas e sementes de tomateiro, a não ser quando a unidade de produção tiver sido sujeita, sob supervisão oficial, a medidas destinadas a eliminar o organismo prejudicial e a remover todo o material vegetal hospedeiro, incluindo, no mínimo, a remoção completa do meio de cultura e a limpeza e, quando necessário, desinfecção da unidade e de todo o equipamento, e quando os serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente tiverem concedido a sua aprovação para fins de produção de batata ou de tomate; e

4.1.4.2 - Para a produção de batata, apenas são utilizadas batatas-semente certificadas ou mini-tubérculos ou micro-plantas provenientes de origens testadas;

4.1.4.3 - Para a produção de tomate, apenas são utilizadas sementes que cumpram as exigências do Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro, ou, no caso de propagação vegetativa, plantas de tomateiro obtidas a partir dessas sementes e cultivadas sob controlo oficial;

4.1.4.4 - São estabelecidos, quando necessário, controlos oficiais dos programas de irrigação e aspersão, os quais podem conduzir à sua proibição, para evitar a dispersão do organismo prejudicial.

4.2 - Dentro da zona demarcada, sem prejuízo das medidas definidas no n.º 4.1, os serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente, devem:

4.2.1 - Imediatamente após a declaração de contaminação, assegurar a limpeza e desinfecção, consoante for apropriado, de toda a maquinaria e armazéns das referidas instalações que estejam envolvidos na produção de batata ou de tomate, utilizando métodos adequados, tal como disposto no n.º 3.

4.2.2 - Imediatamente, e pelo menos durante os três anos de cultura subsequentes à declaração de contaminação:

4.2.2.1 - Nos casos em que a zona tenha sido demarcada ao abrigo da subalínea iv) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º:

a) Garantir, através dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente, o controlo das instalações em que se cultivem, armazenem ou manuseiem tubérculos de batata ou tomate, e também das instalações em que sejam utilizadas máquinas destinadas à produção de batata ou tomate sob contrato;

b) Exigir, para todas as culturas de batata da zona, que só sejam plantadas batatas-semente certificadas ou sementes cultivadas sob controlo oficial, e que sejam analisadas após colheita as culturas de batata-semente efectuadas em locais de produção declarados como provavelmente contaminados nos termos da subalínea iii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º;

c) Exigir que os lotes de batata-semente e de batata consumo colhidas na zona sejam manuseados separadamente ou a intervenção de um sistema de limpeza e quando necessário, desinfecção entre o manuseamento de lotes de batata-semente e batata consumo;

d) Exigir, para todas as culturas de tomate da zona, que só sejam plantadas plantas de tomateiro obtidas a partir de sementes que cumpram as exigências do Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro, ou, no caso de propagação vegetativa, de plantas de tomateiro produzidas a partir dessas sementes cultivadas sob controlo oficial;

e) Realizar uma prospecção oficial nos termos do artigo 3.º

4.2.2.2 - Nos casos em que as águas superficiais tenham sido declaradas contaminadas ao abrigo da subalínea ii) da alínea d) do n.º 1 do artigo 6.º, ou incluídas entre os elementos que eventualmente possam contribuir para a dispersão do organismo prejudicial, nos termos do n.º 2 do anexo V:

a) Realizar nas alturas apropriadas, uma prospecção anual, incluindo uma amostragem das águas superficiais e, quando necessário, de solanáceas hospedeiras que se encontrem junto dos pontos de água e, para os materiais vegetais e noutros casos, a realização de testes de acordo com os métodos pertinentes previstos no anexo II;

b) Estabelecer controlos oficiais dos programas de irrigação e aspersão, incluindo a proibição de utilização das águas declaradas contaminadas para irrigação ou aspersão dos materiais vegetais e, quando necessário, de outras plantas hospedeiras, para evitar a dispersão do organismo prejudicial, sendo que essa proibição pode ser objecto de uma revisão com base nos resultados da citada prospecção anual e essas determinações revogadas, sob condição dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente, obterem a garantia de que as águas superficiais já não se encontram contaminadas, sendo que a utilização das águas sujeitas a proibição pode ser permitida, mediante controlo oficial, para irrigação ou aspersão de plantas hospedeiras, nos casos em que haja recurso a técnicas oficialmente aprovadas para eliminação do organismo prejudicial e prevenção da sua dispersão;

c) Nos casos em que haja contaminação de descargas de resíduos líquidos, estabelecer controlos oficiais da eliminação de descargas de resíduos sólidos ou líquidos provenientes de instalações de transformação industrial ou de embalagem que manuseiem materiais vegetais.

4.2.3 - Estabelecer, quando necessário, um programa de substituição de todos os lotes de batata-semente ao longo de um período de tempo adequado.

ANEXO VII

Eliminação de resíduos associáveis ao organismo prejudicial

1 - Os métodos de eliminação de resíduos oficialmente aprovados a que se refere o n.º 1 do anexo VI devem obedecer às seguintes disposições, por forma a obviar quaisquer riscos identificáveis de dispersão do organismo prejudicial:

1.1 - Os resíduos de batata e tomate (incluindo cascas de batata e batatas e tomates rejeitados) e qualquer outro resíduo sólido associado à batata e ao tomate (incluindo terra, pedras e outro detritos) são sujeitos ao seguinte:

1.1.2 - Eliminação, num local de eliminação de resíduos destinado especificamente a esse efeito e aprovado oficialmente em que não existam riscos identificáveis de fuga do organismo prejudicial para o meio ambiente, por exemplo, através da escorrência para terras agrícolas ou de contacto com pontos de água que possam ser utilizados para irrigação de terras agrícolas, sendo os resíduos directamente transportados para esses locais em condições de confinamento de forma a que não exista risco de perda de resíduos, ou

1.1.2 - Incineração; ou

1.1.3 - Outras medidas, desde que se tenha concluído que não existe qualquer risco identificável de dispersão do organismo prejudicial, sendo essas medidas comunicadas à Comissão Europeia e aos restantes Estados membros.

1.2 - Os resíduos líquidos, antes de serem eliminados, que contenham sólidos em suspensão são sujeitos a processos de filtração ou decantação para remoção dos mesmos, os quais após serem removidos, são eliminados em conformidade com o referido no n.º 1.1.

1.2.1 - Os resíduos líquidos são, depois:

a) Aquecidos a uma temperatura mínima de 60ºC atingida em todo o seu volume durante, pelo menos, 30 minutos antes de serem eliminados; ou

b) Eliminados de outro modo, sujeito a aprovação e controlo oficial, de forma a que não exista qualquer risco identificável de que os resíduos venham a entrarem contacto com as terras agrícolas ou com pontos de água que possam ser utilizados para irrigação da terras agrícolas, devendo os respectivos pormenores ser comunicados aos restantes Estados-membros e à Comissão Europeia.

2 - As opções descritas no presente anexo são igualmente aplicáveis aos resíduos associados ao manuseamento, à eliminação e à transformação de lotes contaminados.